本文要點：具有擴展共軛結構的染料是研究者進行設計和合成的重點，旨在進一步提高并賦予染料光學和電子性能。這些設計使這些染料適用鄰域廣泛，從第二窗口近紅外（NIR-II）生物成像到有機光伏。然而，大共軛的固有優勢往往伴隨著其他挑戰，如聚集、熒光淬滅、吸收藍移、低穩定性和水溶性差。本文介紹了一種結構設計策略來解決這些問題，將這種策略稱為“具有外部水合層的同源二元組"，為開發具有長吸收/發射波長的成像探針量身定制。這種方法涉及通過柔性連接子將兩個七亞甲基花青結合在一起，形成同二元結構，同時創新性地將四個聚乙二醇（PEG9）鏈連接到末端雜環上。這種方法賦予染料出色的水溶性、生物相容性，并增強了化學、光和光譜穩定性。利用這一策略，開發了一種用于NIR-II熒光和3D多光譜光聲斷層掃描成像的生物標志物激活探針（HD-FL-4PEG9-N），及其在疾病可視化中的有效性。由于其高水溶性，它不僅可以用作急性腎損傷成像的可注射探針，還可以用作細菌感染傷口成像的可噴霧探針。

活體成像

方案1. 發色團 HD-FL-4PEG9、探針 HD-FL-4PEG9-N 和激活探針（響應產物）HD-FL-4PEG9-NO 在探針對 NO 的響應時的化學結構。

本文提出了一種結構設計策略“同二元與外部水化層方法"。這種設計復雜的方法旨在解決上述挑戰，并為設計具有長吸收波長的成像探針提供了一種易于操作的策略（方案1）。該策略的核心是將兩個七甲胺花青偶聯，使用相對靈活的連接子產生同位二元，該連接子放大空間過度擁擠以阻止反應劑的攻擊，并避免兩個花青部分之間的大范圍π-π堆積，從而提高化學、光和光學光譜的穩定性。這種方法的另一個方面涉及摻入四個聚（乙二醇）鏈（每個鏈包含九個重復單元的乙二醇，稱為PEG9）。這些PEG9鏈巧妙地位于分子支架的所有四個末端，當在水中水合時，這些PEG9鏈在發色團支架周圍形成外部水合層，因為PEG是生物相容性和親水性聚合物。這種配置確保了染料在水性環境中的生物相容性、高溶解度和穩定性。為了實現NIR-II光學成像，在二元組的兩個中間位置引入了生物標志物響應單元。所得探針名為HD-FL-4PEG9-N，具有高水溶性、化學/光/光譜穩定性、良好的生物安全性和最少的蛋白質結合。隨后，該探針在光學生物成像中用作藥物誘導的急性腎損傷的注射探針和細菌感染傷口的可噴霧探針。這允許通過原位生物標志物（NO）激活的 NIR-II 熒光和光聲成像來可視化和監測疾病。實驗結果證實了探頭優異的成像性能。

圖2. HD-FL-4PEG9的光物理性質

通過微觀取代法將仲胺基團引入HD-FL-4PEG9的兩個介觀位置，使水溶性可激活探針（HD-FL-4PEG9-N）通過NIR-II熒光成像和3D-MOST成像檢測生物標志物NO。在PBS（pH = 7.4,10 mm）中測試了探針HD-FL-4PEG9-N的光譜特性和對NO的響應。在沒有NO的情況下，探針HD-FL-4PEG9-N的吸收帶在640nm處中心（圖2A）。然而，NO的存在和NO水平的增加（NO供體：MAHMA NONOate）導致640nm處的吸收降低，并且在835nm左右出現新的吸收峰，隨著NO水平的增加而逐漸增強。探頭HD-FL-4PEG9-N與不同NO水平反應后的光聲強度如圖2B所示。相對光聲強度也隨著NO水平的增加而增強。圖2C，D顯示，對于探針HD-FL-4PEG9-N，隨著NO水平的增加，熒光強度（發射峰在926 nm）在900–1200 nm范圍內增強，檢測限確定為0.21 μm;而在沒有NO的情況下，探針的熒光幾乎可以忽略不計。并且隨著NO與探針之間反應時間的延長，熒光強度增強（圖2E），反應達到平衡的時間小于10 min，這表明探針對NO的快速響應。此外，MALDI-TOF質譜法證實了HD-FL-4PEG9-N（探針）對NO的響應機制。在用NO孵育后，在質譜圖中，除了探針的m/z峰（1390.8405）外，還會出現另一個分子離子峰，該峰位于m/z 1419.8307處，與HD-FL-4PEG9-NO匹配。這證實了 HD-FL-4PEG9-NO 是由 NO 和 HD-FL-4PEG9-N 之間的反應產生的。此外，為了研究HD-FL-4PEG9-N對NO的選擇性，HD-FL-4PEG9-N（探針）與各種潛在干擾物發生反應。只有NO可以誘導熒光發射或光聲強度的增強，表明HD-FL-4PEG9-N對NO具有良好的選擇性。如圖2F所示，對于探針HD-FL-4PEG9-N或響應產物（HD-FL-4PEG9-NO，在HD-FL-4PEG9-N與NO孵育后），即使在連續激光照射60分鐘后，吸光度也僅略有下降;相比之下，由于光漂白，ICG的吸光度顯著降低，表明與ICG相比，探針和響應產物（活化探針）的光穩定性要高得多。這些數據支持探針HD-FL-4PEG9-N可以快速響應NO并產生光穩定響應產物HD-FL-4PEG9-NO（激活探針），從而相應地產生可用于生物成像的NIR-II熒光和光聲信號。

圖3. 順鉑誘導的 AKI 小鼠模型的雙模式成像實驗

急性腎損傷 （AKI） 是一種以腎功能迅速喪失為特征的病理疾病。在腎損傷部位，其中產生一氧化氮水平升高，進一步加重腎損傷;因此，NO可以作為原位監測腎損傷程度和恢復程度的內源性生物標志物。在本實驗中，我們采用了順鉑誘導的AKI小鼠模型，該模型是根據文獻報道的方法腹腔注射順鉑建立的。然后，用N-乙酰基-l-半胱氨酸（一種臨床使用的抗氧化劑，可保護腎臟免受腎毒性，稱為NAC）治療模型小鼠。采用純光學成像方法NIR-II熒光成像以及光學-超聲混合成像方法多光譜光聲斷層掃描（MSOT）成像監測AKI的程度。光學-超聲混合MSOT成像可以呈現從投影圖像中獲得的高分辨率正交視圖3D圖像，有利于利用3D MSOT圖像提供的3D信息精確定位病變部位。實驗過程如圖3A所示。對于AKI小鼠，NIR-II熒光信號在腎臟中穩步增加，在約6小時達到峰值，然后由于腎臟代謝而減少。相反，健康小鼠（對照組）由于健康腎臟中的NO水平低，因此幾乎沒有熒光。值得注意的是，與沒有NAC治療的模型組相比，用NAC治療的小鼠的熒光信號要弱得多。圖3C顯示，與健康小鼠（對照組）和治療組（通過NAC治療的模型小鼠）相比，模型組的腎臟看起來更蒼白，更腫脹。此外，從圖3D，E中可以明顯看出，對于主要器官，模型組的腎臟顯示出更強的熒光信號，并且該結果與體內NIR-II成像的數據一致。

隨后，探針HD-FL-4PEG9-N被用于小鼠順鉑誘導的AKI的MSOT成像。與對照組（健康小鼠）相比，順鉑誘導的AKI小鼠腎臟中的MSOT信號逐漸增加，在約6 h時達到峰值。然而，在NAC治療的小鼠組中，與沒有NAC治療的模型組相比，可以觀察到更弱的MSOT信號。此外，在探針HD-FL-4PEG9-N靜脈注射后不同時間小鼠的3D-MSOT圖像顯示在圖3F中。很明顯，與對照組（健康小鼠）或NAC治療組相比，模型組的腎臟顯示出更明顯的MSOT信號。顯然，這些MSOT成像數據與NIR-II熒光成像的結果一致。對每組主要器官進行MSOT成像。從圖3G，H可以看出，在主要器官中，模型組腎臟中的MSOT信號強，證實了HD-FL-4PEG9-N分子主要進入腎臟，可以通過響應其中的NO來有效檢測AKI。模型組中的小鼠體重明顯下降，這進一步證實了順鉑的毒性。這些結果證實了探針HD-FL-4PEG9-N確實可以在順鉑誘導的AKI小鼠中被NO有效原位激活，并且可以通過NIR-II熒光成像和MSOT成像實時評估AKI在小鼠中的嚴重程度和治療結果。

皮膚是抵御有害外力防線。因此，開放性皮膚傷口極易受到細菌感染，因為它們可以作為病原體的入口。細菌感染的皮膚傷口中，一氧化氮 （NO） 過表達，可作為原位活化生物成像的內源性生物標志物。因此，為了評估探針HD-FL-4PEG9-N作為可噴霧探針的應用，我們采用了細菌感染的皮膚傷口小鼠模型。細菌感染的皮膚傷口小鼠模型是根據文獻報道的方法建立的，該方法包括金黃色葡萄球菌的損傷、感染和細菌暴露程序，因為金黃色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌，簡稱金黃色葡萄球菌）是最主要的病原體之一，可引起廣泛的臨床表現，是所有常見葡萄球菌中最危險的。實驗過程如圖4A所示。通過將抗菌肽Tet213（KRWWKWWRRC）（Tet213）溶液涂在皮膚傷口部位（第1、2、3、4和5天）（治療組）來治療細菌感染的皮膚傷口。一組未經任何治療的健康小鼠作為對照組。探頭HD-FL-4PEG9-N（2.0mg/kg）在第 3 天、第 7 天和第 12 天噴灑在皮膚傷口部位進行體內成像實驗。如圖4B，G所示，在第7天，在探針噴灑到傷口部位30分鐘后，在模型組小鼠的傷口部位出現明顯的NIR-II熒光信號。相反，在對照組中，由于NO（健康小鼠）水平低，皮膚傷口部位的熒光可以忽略不計。在治療組（用Tet213治療的模型小鼠）中，與模型組相比，傷口部位的熒光信號要弱得多，表明治療后傷口部位的NO水平降低。此外，圖 S38–S41（支持信息）顯示了探針 HD-FL-4PEG9-N 噴灑到皮膚傷口部位后第 3 天或第 12 天記錄的 NIR-II 熒光圖像。接下來，對小鼠細菌感染的皮膚傷口進行MSOT成像。圖 S42–S47（支持信息）顯示了在探針 HD-FL-4PEG9-N 原位噴灑在傷口部位后，在給定日期的不同時間點記錄的小鼠的橫截面 MSOT 圖像。在噴灑探頭后 30 分鐘，模型組的傷口部位出現明顯的 MSOT 信號。然而，對于治療組（用 Tet213 治療），傷口部位顯示很少的 MSOT 信號;在對照組（健康小鼠）中，由于健康小鼠的NO水平較低，傷口部位的MSOT信號可以忽略不計。此外，在探針HD-FL-4PEG9-N噴灑在傷口部位后覆蓋傷口部位的3D-MSOT圖像如圖4C所示。很明顯，與治療組和對照組相比，在小鼠模型組的皮膚傷口部位可以觀察到更強的MSOT信號。這些MSOT成像數據與NIR-II熒光成像的結果一致。

結論：

總之，本研究設計了一種被稱為“具有外部水化層的同源二元體"的結構設計策略，用于設計具有長吸收和發射波長的花青染料。這種創新設計融合了結構元素：a）在同源二元結構中，兩個七次甲基花青通過相對靈活的連接體緊密靠近，這增強了多烯骨架的空間過度擁擠，從而阻礙了反應劑的攻擊，從而提高化學穩定性。這種布置還可以防止大范圍的??–??堆疊，從而避免吸收藍移并確保水介質中的光譜穩定性。b)四個親水性和生物相容性PEG9鏈戰略性地放置在末端雜環上，形成外部水化層。該層不僅具有優異的水溶性和生物相容性，而且還顯著減輕了蛋白質結合。這些組合特性可以顯著增強光學和化學性能。基于這種方法，開發了一種生物標志物響應的NIR-II探針（HD-FL-4PEG9-N），它具有優異的水溶性、良好的化學穩定性、光穩定性和光學光譜穩定性。該探針響應生物標志物NO，產生明顯的NIR-II熒光發射和光聲信號。探針HD-FL-4PEG9-N已成功用作注射探針來成像急性腎損傷，以及噴霧探針通過響應原位生物標志物NO來成像細菌感染的皮膚傷口。特別是，3DMSOT圖像有助于通過3D信息可視化疾病部位/大小。該策略有助于解決大共軛染料長期面臨的固有問題，從而釋放大共軛染料在生物應用中NIR-II熒光成像和光聲成像的潛力。此外，該策略可以為設計用于各種生物應用的其他大共軛生色團提供見解。