本文要點：將分子成像擴展到短波紅外（SWIR，900-1400 nm）區域，可以對生命系統中的生物分子進行深層組織可視化。目前只有吲哚菁綠（ICG）及其類似物被批準用于生物醫學應用，但小于 800 nm 的激發波長限制了這些探針的深層組織穿透和非侵入性熒光成像。在此，介紹了基于ICG的π共軛延伸花青染料，合成ICG-C9和ICG-C11作為生物相容性，以及發射波長分別為922和1010 nm的水溶性SWIR發射探針。此外，還合成了基于 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的熒光標記劑，用于開發 SWIR 分子成像探針。使用 ICG、ICG-C9 和ICG-C11，通過可視化活小鼠的表面受體（EGFR 和HER2）和腫瘤脈管系統來演示乳腺腫瘤的三色 SWIR 熒光成像。此外，本研究展示了使用 ICG 偶聯的抗癌藥物 Kadcyla 和 ICG-C9 或 ICG-C11 偶聯膜聯蛋白 V 對乳腺腫瘤凋亡進行雙色 SWIR 熒光成像。最后，我們展示了Kadcyla誘導的乳腺腫瘤縮小的長期（38天）SWIR熒光成像。本研究為使用生物相容性和水溶性SWIR發射探針進行多重熒光分子成像提供了一般策略。
活體成像
然而，當ICG用作SWIR熒光團時，其激發波長被限制在800nm以下。對于多路復用SWIR熒光成像，需要具有更長激發和發射波長的ICG類似物。增加花青染料聚亞甲基鏈中一個雙鍵的長度有助于將其吸收和發射染料轉移到大約 100 nm 的波長。因此，我們合成了π共軛擴展的ICG類似物ICG-C9和ICG-C11，它們在水相中的發射波長分別以922和1010nm。此外，基于 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 合成了SWIR 熒光標記劑，用于 SWIR 區域的多色熒光分子成像。盡管在合成SWIR熒光探針方面付出了巨大努力，但適用于生物醫學研究的多路SWIR熒光分子成像技術尚未建立。本研究旨在提出一種可用于生物醫學應用的多路復用SWIR分子成像的通用策略。使用與 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的抗體偶聯物，我們通過可視化表面受體（表皮生長因子受體 （EGFR））來演示乳腺腫瘤的多重 SWIR 熒光分子成像和人表皮生長因子受體 2 （HER2）和活小鼠的腫瘤脈管系統。此外，本文演示了使用 ICG 偶聯的 Kadcyla（曲妥珠單抗 emtansine）對腫瘤凋亡進行多路 SWIR 熒光成像和 ICG-C9（或 ICG-C11）偶聯膜聯蛋白 V。最后，我們展示了使用 ICG-C9 偶聯的 Kadcyla 的 SWIR 熒光對乳腺腫瘤縮小進行長期（38 天）成像。通過展示SWIR熒光分子成像，我們的研究結果表明，ICG和基于ICG的π共軛延伸的花青染料應該是生物醫學應用的標準SWIR熒光團。
圖1. ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的光學特性
本文合成了兩種π共軛延伸的花青染料，ICG-C9和ICG-C11，作為ICG類似物用于多路復用SWIR熒光成像。ICG-C9 和ICG-C11 的π偶聯長度比 ICG 中的雙鍵長 1 倍和 2 倍。由于花青染料的熒光隨著聚亞甲基鏈中一個雙鍵的增加而增加約 100 nm，ICG-C9 和ICG-C11 可以發射的波長分別比 ICG 長約 100 或 200 nm。二甲基亞砜 （DMSO） 中 ICG 的熒光為830 nm，而 DMSO 中 ICG-C9 和 ICG-C11 的熒光值分別為 955 nm 和 1078 nm（圖 1b）。與DMSO中的熒光光譜相比，ICG、ICG-C9和ICG-C11在水中的熒光光譜顯示出25-68 nm的藍移（圖1c）。在水相中，ICG、ICG-C9 和 ICG-C11的吸收光譜（圖 1b、c）顯示肩峰的吸光度增加（DMSO 中 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的吸光度分別為 730、805 和 902 nm）。這一發現表明，聚集的花青染料種類的量在ICG<ICG-C9<ICG-C11的順序上增加，自淬滅導致花青染料的熒光亮度降低。盡管ICG、ICG-C9和ICG-C11在純水中的熒光發射非常微弱，但在BSA存在下它們的熒光發射明顯改善。因此，我們使用含有 BSA 的 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 水溶液進行 SWIR 熒光成像。使用三個帶通濾光片（900 ± 25、1000 ± 25 和1100 ± 25 nm）在 785、905 和 975 nm 的不同波長下激發，檢查 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 在水相 （1% BSA） 中的熒光亮度（圖 1d）。當ICG、ICG-C9和ICG-C11的水溶液（1%BSA）在785 nm處被激發時，僅觀察到ICG在900 nm處的SWIR熒光發射。在 905 nm 激發時，ICG-C9 和ICG-C11 在 1000 nm 處觀察到 SWIR 熒光發射。相反，當溶液在975 nm處激發時，ICG-C11發射了1100 nm處的SWIR熒光發射。這些結果表明，使用ICG（Ex：785 nm/Em：900 nm）和ICG-C9（Ex：905 nm/Em：1000 nm）或ICG（Ex：785 nm/Em：900 nm）和ICG-C11（Ex：975 nm/Em：1100 nm）的組合，可以實現多路復用SWIR熒光成像。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在 DMSO 中的熒光量子產率分別為 13%、4.3% 和 2.1%。而ICG、ICG-C9和ICG-C11在水中（1%BSA）的含量分別為3.4%、1.2%和0.12%（圖1e）。接下來，本文研究了 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 在水（1% BSA）中的水穩定性。盡管菁染料ICG、ICG-C9和ICG-C11在水溶液中不穩定。但由于與BSA絡合，BSA的存在顯著提高了它們的化學穩定性（圖1f）。檢測了 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 在785、905 和 975 nm 激光器 （20 mW/cm） 下的光穩定性（圖 1g）。我們觀察到，用激光照射 60 分鐘導致 ICG （30%）、ICG-C9 （25%） 和 ICG-C11 （20%） 發生光漂白。通過測量三種花青染料的時間分辨熒光衰減曲線，檢查了它們的熒光壽命。PBS（1% BSA）中ICG、ICG-C9和ICG-C11的所有熒光衰減曲線均可擬合到一條指數曲線上，ICG、ICG-C9和ICG-C11的熒光壽命分別為0.80、2.7和7.1 ns（圖1h）。
圖2. 合成 SWIR 熒光標記劑、N-羥基琥珀酰亞胺酯 （NHS）、馬來酰亞胺和 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的炔烴衍生物
作為SWIR熒光標記劑，我們合成了ICG、ICG-C9和ICG-C11的N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS）、馬來酰亞胺和炔烴衍生物（圖2a，支持信息，方案S4-S10）。(6,43)與ICG、ICG-C9和ICG-C11偶聯抗體的制備方法如圖2b所示。合成SWIR熒光標記劑的詳細方案和程序在支持信息中進行了描述。雖然熒光標記劑ICG-NHS，(43)ICG-馬來酰亞胺和ICG-炔烴是市售的，其表征尚未報道。在這里，我們描述了ICG-馬來酰亞胺和ICG-炔烴的合成和表征（支持信息，方案S4和S5）以及ICG-C9和ICG-C11的馬來酰亞胺和炔烴衍生物。熒光標記劑ICG-C9-NHS是通過化合物6和NHS之間的酯化反應獲得的（支持信息，方案S6）。化合物6與1-（2-氨基乙基）馬來酰亞胺鹽酸鹽與丙炔胺的縮合反應分別得到ICG-C9-馬來酰亞胺和ICG-C9-炔烴（支持信息，方案S7和方案S8）。類似的縮合反應用于合成ICG-C11-馬來酰亞胺和ICG-C11-炔烴。
本文使用 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的 NHS、馬來酰亞胺和炔烴衍生物對抗體分子進行 SWIR 熒光標記（圖 2b）。NHS衍生物用于標記整個抗體分子中的氨基。馬來酰亞胺衍生物用于標記還原抗體分子中的巰基。最后，利用炔烴衍生物基于點擊化學標記抗體分子，其中疊氮化物基團被引入抗體分子中（圖2b）。SWIR染料抗體（赫賽汀）偶聯物的吸收和熒光光譜如圖2c所示。ICG-Ab、ICG-C9-Ab和 ICG-C11-Ab（Ab：赫賽汀）分別在 820、921 和 1039 nm 處觀察到熒光。根據SWIR花青染料的消光系數，ICG-Ab、ICG-C9-Ab和ICG-C11-Ab的抗體/SWIR染料標記率分別為0.5、0.8和1.1。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在水中的摩爾消光系數為14.7×104， 9.55 × 104和 5.48 × 104M–1cm–1。與 ICG-Ab 和 ICG-C9-Ab 相比，ICG-C11-Ab 的標記率更高可能是由于 ICG-C11 的疏水性更高，導致 SWIR 染料對抗體分子的可及性增加。
本文對活體小鼠的乳腺腫瘤進行了SWIR熒光成像。通過將EGFR陽性的人乳腺癌細胞（MDA-MB-468）移植到裸鼠中來制備攜帶乳腺腫瘤的小鼠。將ICG-NHS-Erbitux、ICG-C9-NHS-Erbitux和ICG-C11-NHS-Erbitux靜脈注射到小鼠體內，并在所有注射ICG-NHS-Erbitux、ICG-C9-NHS-Erbitux或ICG-C11-NHS-Erbitux的乳腺腫瘤中檢測到腫瘤的SWIR熒光發射（>1000nm）（圖3b中第4天的左圖）。在SWIR熒光成像中，ICG、ICG-C9和ICG-C11分別在785、905和975 nm處被激發。由于組織自發熒光較低，具有較長波長（ICG-C9 為 905 nm，ICG-C11 為975 nm）的激發具有較低的背景信號優勢。乳腺腫瘤的離體圖像清楚地表明，SWIR染料-Erbitux偶聯物在乳腺腫瘤中顯著積累（圖3b中的右圖）。
此外，使用由 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的馬來酰亞胺和炔烴衍生物制備的 SWIR 染料-Erbitux偶聯物對攜帶乳腺腫瘤的小鼠進行了 SWIR 熒光成像。與注射SWIR染料-NHS-Erbitux偶聯物的小鼠一樣，在注射SWIR染料-（馬來酰亞胺或炔烴）-偶聯的Erbitux的小鼠中觀察到來自乳腺腫瘤的顯著SWIR熒光發射（圖3c，d）。這些結果還支持 SWIR 染料-（馬來酰亞胺或炔烴）偶聯的 Erbitux 在 EGFR 陽性乳腺腫瘤 （MDA-MB-468） 中的積累。
圖4. 乳腺腫瘤的多重SWIR熒光分子成像
為了實現多路復用SWIR熒光成像，選擇ICG（Ex：785 nm）和ICG-C9（Ex：905 nm）或ICG（Ex：785 nm）和ICG-C11（Ex：905或975 nm）的組合來進行雙色SWIR熒光成像。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在 785、905 和 975 nm 處激發時的熒光強度總結在圖 4d 中。
對于兩種表皮生長因子受體EGFR和HER2的SWIR熒光分子成像，我們制備了兩種類型的乳腺荷瘤小鼠（KPL-4和MDA-MB-468）。在KPL-4細胞移植小鼠中，使用ICG-PD-L1（紅色，Em：1000nm）和ICG-C11-赫賽汀（綠色，Em > 1050nm）的雙色SWIR熒光發射對乳腺腫瘤進行清晰成像（圖4g）。移植MDA-MB-468細胞的腫瘤小鼠（PD-L1陽性和EGFR陽性，圖4e）的雙色SWIR成像也成功。使用ICG-PD-L1（紅色，Em：1000nm）和ICG-C11-Erbitux（綠色，Em：1100nm）進行成像（圖4小時）。此外，我們進行了三色SWIR熒光成像，以可視化KPL-4移植小鼠的兩種表面受體（HER2和EGFR）和腫瘤脈管系統（圖4i）。使用三種類型的SWIR熒光探針（ICG-赫賽汀，ICG-C11-Erbitux和ICG-C9）進行成像。ICG-赫賽汀注射后 1 天進行 HER2 的 SWIR 熒光成像。在 KPL-4 細胞移植腫瘤中觀察到強烈的 SWIR 熒光發射（Em：900 nm，Ex：785 nm）（圖 4i 中第 2 天的紅色圖像）。注射 ICG-C11-Erbitux 后，在腫瘤中還觀察到 ICG-C11-Erbitux 的 SWIR 熒光發射（例如：905 nm，Em > 1050 nm）（圖 4i 中第 3 天和第 4 天的綠色圖像）。紅色和綠色通道的合并圖像清楚地顯示了 HER2 和 EGFR 在 KPL-4細胞移植乳腺腫瘤中的共定位。最后，我們進行了腫瘤新生血管系統的成像(50)通過將ICG-C9（含有1%BSA的PBS中的0.1mM）注射到腫瘤小鼠中（圖4中第4天的青色彩色圖像i）。ICG-C9 用 905 nm 激光激發，并使用 1000 nm 帶路徑濾光片檢測其熒光發射。盡管用 905 nm 光照射會激發 ICG-C9 和 ICG-C11-Erbitux，但 SWIR 熒光主要在 ICG-C9 中觀察到。這是因為注射到小鼠體內的ICG-C9（200μL0.1mM PBS溶液）的量遠大于ICG-C11-Erbitux（100μL1μM PBS溶液）的量。HER2和血管的合并圖像顯示，KPL-4移植小鼠的腫瘤脈管系統是在乳腺腫瘤周圍發育的。
圖5. 腫瘤凋亡的SWIR熒光成像
對于腫瘤凋亡的體內成像，我們制備了細胞凋亡檢測探針，即SWIR染料偶聯的膜聯蛋白V，使用ICG-NHS、ICG-C9-NHS 和ICG-C11-NHS（圖 5a）。SWIR染料偶聯的膜聯蛋白V（ICG-Annexin V、ICG-C9-Annexin V和ICG-C11-Annexin V）的吸收光譜證實了ICG、ICG-C9和ICG-C11與膜聯蛋白V分子的偶聯（圖5b）。將 KPL-4 細胞與和不與 Kadcyla 一起孵育 3 天。在與 Kadcyla 一起孵育的 KPL-4 細胞中檢測到 ICG 偶聯膜聯蛋白 V 的熒光信號，但在對照細胞（與無 Kadcyla 一起孵育）中未檢測到。這些結果表明，ICG-Annexin V可用作活細胞中的凋亡檢測探針。在靜脈注射Kadcyla的KPL-4細胞移植腫瘤小鼠中進行腫瘤凋亡的SWIR熒光成像。注射Kadcyla后1天，將ICG-Annexin V注射到小鼠體內，通過檢測腫瘤中ICG-Annexin V的SWIR熒光（>1000 nm）進行SWIR熒光成像。與對照小鼠（Kadcyla?）相比，注射Kadcyla的小鼠（Kadcyla+）表現出來自乳腺腫瘤的強烈SWIR熒光發射，表明Kadcyla誘導腫瘤凋亡（圖5d）。對兩只小鼠（Kadcyla +和Kadcyla?）的腫瘤離體圖像的比較清楚地表明，在注射Kadcyla的小鼠中誘導了腫瘤凋亡（圖5d中的右圖）。為了確認 Kadcyla 誘導腫瘤凋亡，我們使用 ICG 偶聯的 Kadcyla （ICG-Kadcyla） 和 ICG-C9-Annexin V 或 ICG-C11-Annexin V 進行雙色 SWIR 熒光分子成像。ICG-Kadcyla（紅色）和ICG-C9-（或ICG-C11-）膜聯蛋白V（綠色）的合并圖像顯示了Kadcyla和膜聯蛋白V在乳腺腫瘤中的共定位（圖5e，f中上圖的右圖）。這表明 Kadcyla 誘導的 KPL-4 移植裸鼠的腫瘤凋亡。相比之下，對照小鼠（注射無Kadcyla）沒有顯示來自腫瘤的ICG-C9-Annexin V或ICG-C11-Annexin V的SWIR熒光發射（圖5e，f中的下圖圖像）。
圖6. ICG-C9-Kadcyla誘導的乳腺腫瘤縮小的長期SWIR熒光成像
最后，本文研究了花青染料的SWIR熒光是否可用于體內腫瘤凋亡的長期成像。為了監測抗腫瘤藥物Kadcyla誘導的腫瘤凋亡，我們通過用ICG-C9-NHS標記Kadcyla來制備ICG-C9偶聯的Kadcyla（ICG-C9-Kadcyla）。在注射ICG-C9-Kadcyla的乳腺腫瘤（KPL-4）小鼠中進行長期SWIR熒光成像。在ICG-C9-Kadcyla注射后2-38天采集SWIR熒光圖像（圖6a）。注射Kadcyla后約1個月，乳腺腫瘤的大小減小了12倍（圖6b，c），表明Kadcyla誘導的腫瘤縮小顯著。此前，我們報道了使用 ICG-赫賽汀和 ICG-C11-膜聯蛋白 V 分別對腫瘤凋亡進行 9 天和 15天的長期成像。目前使用ICG-C9-Kadcyla的結果，加上早期報道的結果，表明ICG-C9的SWIR熒光發射以及ICG和ICG-C11的SWIR熒光發射適用于活小鼠腫瘤凋亡的長期成像。
結論
本文開發了π共軛延伸的花青染料，ICG-C9和ICG-C11。SWIR成像技術的重要特點是使用在SWIR區域發射的生物相容性和水溶性花青染料ICG-9和ICG-C11。ICG-9 和 ICG-C11 可以在大約 900 和1000 nm 處激發，從而實現多色 SWIR 熒光成像。使用ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的抗體偶聯物，我們展示了 HER2 陽性和 EGFR 陽性荷瘤小鼠表面受體和腫瘤脈管系統的多路 SWIR 熒光成像。此外，還展示了抗癌藥物Kadcyla誘導的乳腺腫瘤縮小的長期（38天）SWIR熒光成像。
參考文獻
Swamy M M M, Murai Y, Monde K, et al. Biocompatible and Water-Soluble Shortwave-Infrared (SWIR)-Emitting Cyanine-Based Fluorescent Probes for In Vivo Multiplexed Molecular Imaging[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2024, 16(14): 17253-17266.
?? ?? ??
近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS
NIR-II in vivo imaging system
高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優于3um多模態系統 - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區熒光成像、原位成像光譜，CT等顯微鏡 - 近紅外二區高分辨顯微系統，兼容成像型光譜儀?? ?? ??
恒光智影
上海恒光智影醫療科技有限公司，被評為上海市“科技創新行動計劃"科學儀器領域立項單位。
恒光智影，致力于為生物醫學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供一體化的成像解決方案。
與基于可見光/近紅外一區的傳統熒光成像技術相比，我們的技術側重于近紅外二區范圍并整合CT, X-ray，超聲，光聲成像技術。
可為腫瘤藥理、神經藥理、心血管藥理、大分子藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫藥與科學儀器服務。
