本文要點：無chuang成像技術可以用于可視化骨生長、異常和代謝，同時在骨的圖像引導干預和外科手術中發揮著重要作用。然而，目前還沒有骨特異性NIR-II成像探針，能夠實時無chuang檢測骨生長和組織微鈣化。本研究基于結構固有靶向(SIT)策略，設計靶向近紅外熒光團用于骨組織的無chuang成像，其中靶向基團或藥效團被納入熒光團的化學結構中。我們對先前開發的近紅外熒光團進行了改進，以生成一種腎臟可清除的骨靶向造影劑。該造影劑具有改進的光學性能和生物分布，此外還能產生光熱效應(圖1a)。通過在介碳中引入硫原子，zui終熒光團的峰值發射波長轉移到NIR-II范圍內，對光照射的敏感性提高。

背景: 由于NIR-II熒光成像可穿透組織深處并減少散射，因此在檢測骨生長、代謝、轉移及其他骨相關疾病方面，NIR-II熒光成像優于常規可見和NIR-I熒光成像。而P800SO3-PEG對骨組織具有高親和力，更深的組織成像能力，其在主要器官中zui小的非特異性攝取以及對激光照射的光熱效應，使其成為骨靶向治療診斷成像的zui嘉選擇。

方法: 首先，作者為了研究其穩定性與濃度的關系，將P800SO3-PEG溶于DI水中，在5%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水中制備不同濃度10~250μM的工作溶液。為了獲得光穩定性，使用808nm激光二極管以35mW/cm2連續照射200μL的工作溶液，每30分鐘成像一次，持續120分鐘。通過測量感興趣區域(ROI)并將熒光強度與起始熒光信號進行比較來確定其穩定性。之后作者為了測定其光熱效應，在10mM DMSO染料原液中在1XPBS溶液中制備30μM的ICG、P800SO3和P800SO3PEG。以PBS作為對照。將500μL的工作溶液和空白PBS置于1mL試管中，用808nm激光二極管以1W/cm2的速度照射2分鐘，用熱成像相機成像。每15秒記錄每個熒光團的熱讀數。

作者隨后做了鈣鹽實驗，將碳酸鈣、草酸鈣、羥基磷灰石、磷酸鈣、焦磷酸鈣鹽(25 mg/mL)分別用5μM工作溶液置于1mL的生理鹽水中孵育。將鈣鹽與熒光團在室溫下連續旋轉30分鐘。然后用生理鹽水洗滌混合物3次，然后以3000轉/分離心10分鐘，以除去未反應的熒光探針。為了比較其結合親和力，作者將離心后收集的沉淀分散在200μL的生理鹽水中，熒光成像系統測定分散樣品的熒光強度。所有近紅外熒光圖像在相同的曝光時間下采集，并以相同的歸一化顯示。

實驗動物選擇了CD-1小鼠(6-8周，雄性)和無體型NCr nu/nu小鼠(6周)。作者為了研究每個近紅外熒光團的生物分布和清除率，從10mM DMSO原液中提取0.25-1.0mM的含5%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水配制工作溶液，每個近紅外熒光團100μL(25-100 nmol)經眶后竇靜脈注射，術中近紅外熒光成像后處死動物，切除主要臟器，包括心、肺、肝、胰、脾、腎、十二指腸、腸、肌肉等，并成像觀察組織特異性生物分布。每個器官/肌肉上方感興趣區域(ROI)的熒光強度使用ImageJ版本1.52 2p進行量化。信背比記為SBR。

作者為了測定近紅外熒光團的組織分布，在CD-1小鼠注射了50 nmol的P800SO3PEG，在100μL的5%wt/vBSA/生理鹽水后的第1天和第14天摘除骨組織。將解剖的組織裁剪并埋入組織-Tek zui嘉切割溫度(OCT)化合物中，不進行預固定步驟，組織塊在-80℃冷凍。用低溫制冷機切割Tµm厚的冷凍切片。玻片*行熒光分析，然后進行蘇木精和伊紅(H&E)染色。調整曝光時間以獲得每個熒光圖像相似的zui大熒光值。作者還從匹配的視場中獲得了h&e染色玻片的亮場圖像。

結果: 骨靶向近紅外熒光團的理化性質：如圖1b所示，在P800SO3周圍設計P800SO3-PEG，用血清穩定但靈活的硫醇PEG連接劑取代根草酸連接劑，導致zui大吸收光譜和發射光譜的光束漂移，從而實現NIR-II尾跡成像。骨靶向近紅外熒光團的理化性質見表1，分布系數對數D是血液中zui終化合物的親脂性和血清蛋白結合的重要預測因子，P800SO3-Cl是親水性的，但通過在骨架上添加SH或PEG增加了親水性，這分別將對數D降低到-7.04和-8.65。而拓撲極表面積（TPSA）是組織吸收和滲透的指標。而表2總結了在10%胎牛血清(FBS)中測定的骨靶向近紅外熒光團的光學性質，P800SO3-Cl在817 nm處熒光zui強，消光系數高。在同一七甲基氨酸主鏈的中碳上，氧取代導致熒光發射的低色移，而硫原子取代產生42-45 nm的淺色移，從而實現了NIR-II尾成像(圖1e,f)。

圖1

表1

骨靶向近紅外熒光團的血漿蛋白結合，光穩定性和光熱效應：首先是骨靶向近紅外熒光團的血清穩定性，作者使用快速平衡透析(RED)裝置測量了它們的血漿蛋白結合(PPB)(圖1g)。在濃度為10µM的5%含牛血清白蛋白(BSA)生理鹽水中制備近紅外熒光團，在37°C溫和振蕩孵育8h。利用ICG作為對照。P800SO3-Cl和P800SO3-PEG顯示約40%的PPB，而P800SO3和P800SO3-SH顯著結合血漿蛋白(>70%)。作者為了測量了這些近紅外熒光團在不同濃度(10-100μM)下的光穩定性，在自制的NIR-II成像系統下，使用功率密度為35mW/cm2的808nm激光照射2h，P800SO3和P800SO3Cl在>50µM時表現出較好的光穩定性。然后，作者在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中固定每個熒光團的濃度為30μM，并在808 nm激光下照射樣品2分鐘，以證明其假設，這些近紅外熒光團顯示光熱效應如圖1h所示。總的來說，在激光照射下，所有測試的近紅外熒光團都觀察到升高的溫度變化(10-15°C)。其中，P800SO3-PEG和P800SO3-SH表現出zui快的光熱效應，這與圖S3a中它們的光敏性結果一致。與P800SO3相比，P800SO3- peg的升溫要高2-4℃，這可能是由于每個聚甲基鏈的電子密度和空間位阻的差異所致。

骨靶向近紅外熒光團物理化學穩定性的測量：作者分別在DI水中制備1mM和5μM工作液，測定P800SO3-PEG的熱穩定性和pH穩定性。P800SO3-PEG在-80~25°C的廣泛溫度范圍內孵育8小時后顯示了合理的熱穩定性。

鈣鹽結合試驗：作者進一步測量了NIR-I和NIR-II窗口（圖2a）中NIR熒光團的熒光發射尾部，然后體外測試這些熒光基團結合生物相關鈣鹽的能力，包括羥基磷灰石（HA）、碳酸鈣（CC）、磷酸鈣（CP）、草酸鈣（CO）和焦磷酸鈣（CPP）。在人體內發現的五種主要鈣鹽中，HA是主要成分，也存在于動脈粥樣硬化斑塊和骨腫瘤中。通常，在測定中，沒有熒光基團與CPP表現出強烈的結合。與其他3種熒光基團相比，P800SO3-Cl在NIR-I和近紅外-II窗口內與HA的結合力更強，但其在HA、CC、CP和CO之間的結合差異很小。總體而言，NIR-II窗口中骨靶向藥物的信號強度比NIR-I窗口中的信號強度高十倍。為了找到更詳細的與鈣鹽的結合模式和形態，選擇P800SO3-PEG并在近紅外顯微鏡下觀察。如圖4所示，在HA、CP和CO中觀察到較強的信號，但在CPP中幾乎沒有觀察到任何信號，表明結合zui小，這與圖2b中的體外數據一致。

圖2

骨特異性靶向：作者為了評估骨特異性結合以及生物分布和清除率，將50 nmol的每種NIR熒光團靜脈內施用于CD-1小鼠，并在NIR-I和NIR-II窗口下成像，直到注射后4小時（如圖3所示）。在成像之前，所有內臟器官都被切除，仰臥姿勢被固定。所有注射的NIR熒光團都成功地突出了小鼠的胸椎，腰椎和骶椎，以及脊髓肋骨，髂骨和膝關節，具有高熒光信號（圖3a，b）。P800SO3-Cl的LogD值相對較高，對HA的結合選擇性較差，因此在肌肉和皮膚中表現出較高的非特異性攝取，導致三者中的SBRzui低（NIR-I≈2.3，NIR-II≈3.9）。另一方面，P800SO3-SH由于在低濃度（<50μM）下光穩定性差，因此在骨骼和背景組織中顯示出整體低信號。P800SO3-PEG呈現出zui小的背景信號，整個骨骼結構清晰地凸顯出來。

圖3

生物分布和藥代動力學：作者評估了P800SO3-PEG的藥代動力學和排泄途徑（圖4a）。P800SO3-PEG迅速分布到全身，并迅速從血液中清除。不像P800SO3，P800SO3的間隙較慢。因此，P800SO3-PEG在曲線下顯示小面積（AUC）和合理的清除率（0.23 mL / min），導致4小時內快速排泄尿（74%ID）。

無chuangNIR-II成像：在NIR-II窗口中，在測試的劑量范圍內清楚地檢測到顱骨，肩胛骨，脊柱，髂骨和部分股骨。在50nmol的劑量下獲得22.0±1.3的zui大平均SBR值。P800SO3-PEG通過腎臟清除進入膀胱而從體內消除，即使在zui高劑量為100 nmol的情況下，非骨組織也不會對其進行非特異性攝取。圖4c比較了靜脈注射P800SO3-PEG后小鼠1天和14天的膝蓋，顱骨，脊柱和尾巴的骨成像。放大的骨圖像顯示了組織中骨信號分布的變化。在膝關節中，骨骺和形骺是代謝活躍的區域，信號隨著時間的推移而減少或消失，并重新分布到脛骨和股骨中。另一方面，生長板中沒有信號，因為它是軟骨組織。至于顱骨和上頜骨，隨著時間的推移，邊緣輪廓信號變得更加明顯。后軀干的平面形狀顯示脊柱（包括胸椎、腰椎和骶椎）、髂骨和部分背肋骨。在NIR-II窗口下，棘突中的信號逐漸減少，而橫向過程中的信號被保留。圖4c還顯示了非皮膚小鼠的精確尾椎成像。經過兩周的沉積，每個尾錐都發出高信號強度，并且可以在視覺上分離。椎間盤中沒有熒光信號，因為它是纖維軟骨組織。第1天對縱向骨骼的H&E和顯微分析顯示骨表面的熒光信號（圖4d）表明軟骨（白色箭頭），注射后第14天的成像顯示P800SO3-PEG穩定地摻入骨基質（黃色箭頭），隨著時間的推移，額外的正常骨基質沉積在NIR熒光團的頂部。對松質骨的顯微鏡分析表明，該區域的周轉率很高（即去除P800SO3-PEG標記的組織（藍色虛線）和/或延遲新骨沉積（無熒光）。

圖4

3D熒光層析成像：計算機斷層掃描（CT）是zui常見的成像方法，廣泛用于在宏觀和微觀水平上提供骨骼圖像。此外，由于廣角（360°）采集熒光數據，3D熒光斷層掃描提供了查看深層組織NIR熒光成像的機會。熒光發射計算機斷層掃描（FLECT）/CT系統通過采集動物主體周圍的360°投影圖像并隨后進行精確的圖像重建，可以捕獲真實的3D斷層掃描圖像。圖5顯示了在InSyTe FLECT / CT成像系統下通過3D熒光斷層掃描P800SO3-PEG在各種骨組織中的體內分布。與其他組織相比，P800SO3-PEG在注射后4 d顯示出明顯的骨攝取。圖5a顯示了P800SO3-PEG在脊柱和骨關節中的積累。該數據還表明P800SO3-PEG優先積累在代謝活躍的骨骼區域。殘余微弱的腎臟信號表明P800SO3-PEG的腎清除率穩定。冠狀動脈和矢狀面圖像還顯示P800SO3-PEG在膝蓋，肩部和脊柱中大量積聚（圖5b，c）。

圖5

結論:  P800SO3-PEG與骨基質具有高效快速的結合，并且由于由雙膦酸鹽和磺酸鹽以及柔性硫醇PEG連接劑組成的平衡骨架，腎臟清除率相對較快。與我們之前報道的骨靶向藥物P800SO3和其他基于雙膦酸鹽的NIR熒光造影劑相比，P800SO3-PEG具有幾個優點：1）通過更高的SBR改善骨特異性靶向。2）zui大吸收和發射光譜在800nm左右，與傳統的NIR成像系統兼容。3）改進了NIR-II窗口下的無chuang成像。4）硫醇誘導的光熱療法治療骨腫瘤，轉移和傳染病。此外，與主要保留在體內或顯示緩慢肝膽排泄的典型NIR-II熒光納米顆粒不同，腎透明P800SO3-PEG顯示出快速排泄和良好的生物相容性，不會干擾肝臟，脾臟和其他器官。P800SO3-PEG對骨組織具有較高的親和力，具有較強的組織成像能力，在主要器官的非特異性吸收zui小，且具有激光照射下的光熱效應，是骨靶向治療成像的zui嘉選擇。

參考文獻

doi.org/10.1186/s40824-022-00294-2

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近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

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高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優于3um

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顯微鏡 - 近紅外二區高分辨顯微系統，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

          上海恒光智影醫療科技有限公司，專注于近紅外二區成像技術。致力于為生物醫學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供*的、一體化的成像解決方案。自主研發近紅外二區小動物活體熒光成像系統-MARS。

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          同時，恒光智影還具備探針研發能力，我們已經成功研發了超過15種探針，這些探針將廣泛地應用于眾多生物科技前沿領域的相關研究中。