本文要點:通過單個熒光團同時檢測不同的疾病具有挑戰性。本文報告了一種名為Cy-914的雙色熒光團,利用其NIR-I / NIR-II雙色成像功能同時診斷非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和轉移性腸癌。pKa為6.98的Cy-914對pH值和粘度都具有高敏感性。在酸性腫瘤微環境中,795 nm處顯示NIR-I熒光,同時在中性至微堿性條件下914/1030 nm處顯示強烈的NIR-II熒光。此外,Cy-914可以靈敏且wu創地監測NAFLD進展過程中的粘度變化。更重要的是,它能夠在兩個獨立的通道中同時顯示NAFLD(ex / em = 808 / 1000-1700 nm)和腸道轉移(ex / em = 570 / 810-875 nm),且局部噴灑后沒有光譜交叉干擾,進一步改善了小于3 mm的微小轉移灶的熒光引導手術。
背景:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)正在成為zui常見的以肝細胞脂肪變性為特征的慢性肝病,在全qiu成人中患病率為25%。如果NAFLD沒有及時診斷和治療,它將有發生肝硬化和肝癌的風險;同時,由于轉移性腫瘤體積小、血管化程度低、分布散,檢測和切除轉移性腫瘤具有挑戰性。迄今為止,常規超聲、磁共振成像和計算機斷層掃描已被臨床用于NAFLD 和腸癌的診斷。然而,這些方法只能提供解剖學和病理學圖像,在靈敏度,空間分辨率和安全性方面受到限制。因此,仍然需要在分子水平上開發高度靈敏和特異性的診斷方法,以便早期準確地檢測NAFLD和轉移性腸癌,進一步防止其惡化并改善其治療。近紅外區域(NIR-I:700-900 nm,NIR-II:1000-1700 nm)的熒光成像由于其高靈敏度,良好的時空分辨率和wu創可視化(特別是在NIR-II窗口中)具有巨大的潛力,由于光子散射和自發熒光減少,可提供更高的空間分辨率和更深的體內組織穿透。因此,可以響應生物標志物和細胞微環境的智能可激活NIR熒光探針有望用于NAFLD和轉移性腸癌的早期準確診斷。
研究內容:作者shou次開發了三種具有雙色成像能力的雙色熒光團(BCFluors),用于NAFLD和轉移性腸癌的體內診斷。每個BCFluors都由供體-π-受體(D-π-A)結構,雙鍵橋接轉子和苯酚基組成,分別實現強烈的熒光發射,對粘度的敏感響應和對pH的快速響應。通過對π共軛骨架的擴展,產生了一個名為Cy-914的NIR-I /NIR-II BCFluor,具有可調的激發和發射光譜。在酸性腫瘤微環境中,pKa為6.98的Cy-914在570 nm激發下795 nm處顯示開啟NIR-I熒光。同時,在微堿性粘稠環境中,Cy-914的峰值吸收將紅移至819 nm,進一步觸發914/1030 nm處的強NIR-II熒光,由于酚羥基的去質子化和增強的分子內電荷轉移機制,在1200 nm處尾部發射。隨著粘度的增加, Cy-914 在 914 和 1030 nm 處分別顯示出 72 倍和 53 倍的熒光增強。(Figure.1)
Figure1
三種BCFluors的設計和合成路線Fig.2a所示。作者選擇了具有D-π-A結構的半菁來構建具有較大斯托克斯位移的BCFluors。BCFluors(Cy-700,Cy-805和Cy-914)是通過簡單的克腦文蓋爾縮合反應合成的。為了使其對pH敏感,將酚基與骨架鏈接以調節不同pH條件下的熒光發射波長。為了使其對粘度敏感,受體1-乙基苯并[c,d]碘鎓和供體苯酚通過一到三個旋轉雙鍵橋接。在低粘度介質中,這樣的D-π-A結構可以自由旋轉,導致激發態的強非輻射衰變。反之,在高粘度時,由于分子內自由旋轉受限,則會引發強烈的熒光。Cy-700、Cy-805 和 Cy-914 具有pH/粘度響應的雙色成像能力,在酸性 pH 緩沖溶液中分別在 617、700 和 795 nm 處表現出熒光發射zui大值,在微堿性粘稠條件下分別在 700、805 和 914/1030 nm 處表現出峰值發射(Figure.2bc)。此外,Fig.2e總結了這些BCFluors的pKa分別在6.30、6.89和6.98的其他光譜特性。為了進一步了解隨著雙鍵數的增加而波長的紅移,使用DFT計算了三個BCFluors的HOMO和LUMO能級(Figure.2d)。它們在整個D-π-A骨架上的離域HOMO和LUMO相似,而它們的HOMO-LUMO帶隙差異明顯,分別為2.52、2.22和1.99 eV,表明通過雙鍵擴大π共軛系統可以有效地縮小能隙,并以顯著的紅移導致NIR吸收和發射。
Figure2
作者繼續驗證Cy-914的光譜特性。由于它具有很高的 NIR-I/NIR-II 雙色成像潛力,首先測量了 Cy-914 在不同 pH 緩沖溶液中的吸收和發射光譜。如Figure.3a所示,Cy-914在酸性和堿性條件下表現出顯著不同的光譜性質,在pH 5.0檸檬酸鹽緩沖液中,在570/795 nm處顯示出峰值吸收/發射。在pH值為8.8的檸檬酸鹽緩沖液中,由于酚羥基的去質子化和增強的細胞內電荷轉移過程,分別觀察到720和914/1030 nm處的峰值吸收和發射。為了進一步檢驗其對腫瘤酸性pH的敏感性,進行了pH滴定。隨著pH值的降低,720 nm處的吸收消失,570 nm處的峰值吸收出現,在795 nm處的峰發射逐漸增加,pKa為6.98,淺綠色溶液變為紫色(Figure.3bc)。同時,Cy-914通過在3.0和11.0之間交替改變pH值,即使在五個循環后也具有出色的pH可逆性(Figure.3d)。更重要的是,Cy-914表現出良好的化學穩定性,不受金屬離子,氨基酸和活性氧等常見生物物種的干擾。其中,只有質子能夠在795nm處觸發強烈的NIR熒光(Figure.3e)。值得注意的是,Cy-914在不同pH緩沖液中的熒光圖像表明,它能夠進行雙色成像,在酸性條件下顯示NIR-I熒光,以及在中性或微堿性pH下顯示NIR-II熒光(Figure.3f)。接下來,為了進一步研究Cy-914對粘度的敏感性,作者檢查了探針在不同比例的水 - 甘油混合物中的吸收和熒光發射光譜。在非粘稠水(pH 8.0)中,由于分子內自由旋轉,在914nm處觀察到非常弱的熒光。相反,在914/1030 nm處呈現出強烈的NIR-II熒光,并隨著粘度從0.89 cP(一百%水)而逐漸增加到163.60 cP(90%甘油),在914和1030 nm處分別表現出72倍和53倍的熒光增強(Figure.3gh)。作者進一步測試了Cy-914在具有不同極性的不同溶劑中的熒光光譜,只有高粘度才能打開其強烈的NIR-II熒光(Figure.3i)。
Figure3
由于Cy-914是一種NIR-I/NIR-II成像染料,其發射波長超過共聚焦顯微鏡的范圍,作者接下來使用Cy-700進行雙色細胞成像,因為它們具有相似的pH/粘度響應(Figure.4a)。為了檢查Cy-700的細胞器靶向能力,將HeLa細胞與Cy-700和線粒體綠色熒光探針一起孵育。如Figure.4b所示,紅色通道和綠色通道融合得非常好,皮爾遜系數高達0.91。Cy-700具有良好的線粒體靶向能力,進一步應用于HeLa細胞的線粒體粘度成像。制霉菌素是一種zhong所zhou知的藥物,可以破壞線粒體功能障礙并誘導粘度變化。當細胞單獨與Cy-700一起孵育時,紅色通道中的微弱熒光(λex:637 納米, λem:663-738 nm)被觀察到(Figure.4c)。相比之下,當用制霉菌素預處理細胞時,顯示約2.5倍的紅色熒光增強(Figure.4e)。為了進一步研究其體外雙色成像能力,作者應用Cy-700監測線粒體自噬的pH變化。首先將HeLa細胞與Cy-700孵育2小時,然后用無血清培養基處理以用于饑餓誘導的線粒體自噬。綠色通道中的熒光信號 (λex:487 納米, λem:570-620nm)顯著增加,饑餓3 h后熒光增強2.3倍(Figure.4df)。接著進一步評估Cy-914在體外檢測酸性pH和粘度的能力。如Figure.4gh所示,由于pH值降低,負載Cy-914的細胞在饑餓誘導處理時表現出較高的NIR-I熒光,同時,由于線粒體粘度增加,制霉菌素處理的細胞表現出強烈的NIR-II熒光。
Figure4
接下來應用Cy-914來跟蹤NAFLD小鼠模型中的粘度變化。NAFLD小鼠模型是通過喂食高脂肪飲食(60千卡%脂肪)和注射地塞米松建立的。然后,在第5天,第10天和第15天將小鼠注射Cy-914,第0天小鼠為正常飲食的對照組。與正常小鼠相比,不同程度的脂肪肝小鼠表現出顯著更高的NIR-II熒光,特別是在第10天,高信背景比為2.6 / 1。此外,由于腹部脂肪的增加和光穿透的衰減,第15天的NAFLD小鼠顯示出熒光略有下降(Figure.5ab)。為了進一步驗證NAFLD的成功產生,在選定的日期分離小鼠的肝臟。正常的肝臟呈現深紅色,表面光滑;相比之下,NAFLD組中擴大的肝臟顯示出黃色,表面油膩,肝臟中顯示出更強的NIR-II熒光,高達1.9倍(Figure.5cd)。此外,蘇木精和曙紅(H&E)染色進一步驗證了NAFLD模型的成功建立,顯示肝細胞腫脹和肝索紊亂(Figure.5e)。為了進一步檢查生物分布,在注射后1小時通過NIR-II熒光成像收獲并分析主要器官(Figure.5f)。Cy-914在肝臟和脾臟中表現出強烈的NIR-II熒光,并且由于粘度隨著脂肪肝的進展而增加,只有肝臟顯示出增強的NIR-II熒光(Figure.5g)。
Figure5
zui后,建立了攜帶NAFLD和轉移性腸癌的小鼠模型。如Figure.6a所示,首先用高脂肪飲食喂養小鼠并注射地塞米松以誘導脂肪肝,并在第5天,腹膜內注射用熒光素酶表達的4T1-Luc細胞以產生轉移性腸腫瘤。在腹部觀察到顯著的生物發光信號,表明成功產生腸道轉移(Figure.6b)。在肝臟和腸道表面局部噴灑Cy-91430秒后,強烈的NIR-II熒光(λex:808 nm, λem:1000-1700nm)在脂肪肝中快速清晰地觀察到,顯示出比正常肝臟高1.6倍的熒光,同時在腹部有顯著的NIR-I熒光信號(λex:570nm,ICG通道)伴有腸道轉移,顯示1.9倍高的熒光(Figure.6bc)。為了進一步檢查離體熒光,收獲了實驗組和對照組的肝臟和腸道,在脂肪肝中表現出強烈的NIR-II熒光,在轉移性腸腫瘤中表現出NIR-I熒光(Figure.6d)。值得注意的是,通過利用局部噴灑和NIR熒光引導手術,可以清楚地檢測到小于3 mm的微小腸道轉移并精確切除,通過生物發光成像和H&E染色分析進一步證實(Figure.6e)。
Figure6
總結:作者成功設計并合成了BCFluor,Cy-914,具有pH和粘度響應特征,用于體內雙色疾病診斷,沒有光譜交叉干擾。探針Cy-914通過響應pH/粘度表現出可調諧的NIR-I/NIR-II熒光,在酸性微環境中顯示出顯著的NIR-I熒光(795 nm),在中性至微堿性條件下表現出強烈的NIR-II熒光(914/1030 nm)。值得注意的是,它能夠通過利用NIR-II熒光成像來靈敏且wu創地監測NAFLD進展中的粘度變化。更重要的是,Cy-914允許在局部噴灑后在兩個獨立的通道中同時檢測NAFLD和轉移性腸癌,進一步改善了熒光引導下小于3mm的微小腸轉移的手術切除。該研究為通過單個熒光團進行多疾病診斷提供了一種新穎的策略,Cy-914有望在未來用于檢測其他pH/粘度相關疾病的應用。
參考文獻
doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03100
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近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS
NIR-II in vivo imaging system
高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機,活體穿透深度高于15mm
高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭,空間分辨率優于3um
熒光壽命 - 分辨率優于 5us
高速采集 - 速度優于1000fps (幀每秒)
多模態系統 - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區熒光成像、原位成像光譜,CT等
顯微鏡 - 近紅外二區高分辨顯微系統,兼容成像型光譜儀
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恒光智影
上海恒光智影醫療科技有限公司,專注于近紅外二區成像技術。致力于為生物醫學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供*的、一體化的成像解決方案。自主研發近紅外二區小動物活體熒光成像系統-MARS。
與基于可見光波長的傳統成像技術相比,我們的技術側重于X射線、紫外、紅外、短波紅外、太赫茲范圍,可為腫瘤學、神經學、心血管、藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果,助力科技研發。
同時,恒光智影還具備探針研發能力,我們已經成功研發了超過15種探針,這些探針將廣泛地應用于眾多生物科技前沿領域的相關研究中。
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