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一、熱原(progon)醫(yī)院臨床在使用藥品注射劑時(shí)，常有發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、膚色灰白、休克、嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡，這種癥狀稱為熱原反應(yīng)。為提高藥品質(zhì)量和用藥安全，人們對(duì)熱原進(jìn)行了廣泛的研究，直到1923年Seibert提出了用家兔檢測(cè)熱原的方法。在1942年美國(guó)藥典首先將家兔熱原檢查項(xiàng)收入藥典成為法定方法，中國(guó)藥典1953年版開始收載該方法，隨后的世界各國(guó)藥典都以動(dòng)物熱原檢查法作為藥品質(zhì)量監(jiān)測(cè)的方法之一。家兔熱原檢查法的優(yōu)點(diǎn)，可在規(guī)定時(shí)間里觀察到家兔的體溫變化，相應(yīng)反應(yīng)了熱原質(zhì)引起
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細(xì)菌內(nèi)毒素，英文稱作Enolotoxin，是G-菌細(xì)胞壁個(gè)層上的*結(jié)構(gòu)，內(nèi)毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細(xì)胞等，使之釋放出一種內(nèi)源性熱原質(zhì)，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱。內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分為脂多糖中的類脂A細(xì)菌內(nèi)毒素這個(gè)概念在1890年的時(shí)候就已被提了出來，它是在研究發(fā)熱物質(zhì)過程所引成的，1933年Boivinzui先由小鼠傷寒桿菌提取出來，進(jìn)行化學(xué)免疫學(xué)方面的研究，到1940年時(shí)候，Morgan使用志賀氏痢疾菌闡明了細(xì)菌內(nèi)毒素是由多糖脂質(zhì)及蛋白質(zhì)三部分所組成的復(fù)合體，到了1950年以后，隨
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實(shí)驗(yàn)原理帶電荷的蛋白質(zhì)，在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動(dòng)稱為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，但大都在pH7以下，若將血清置于pH8.6的緩沖液中，則這些蛋白質(zhì)均帶負(fù)電，在電場(chǎng)中都向陽極移動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中所帶負(fù)電荷多少及分子大小不同，所以在電場(chǎng)中向陽極泳動(dòng)速度也不同。蛋白質(zhì)分子小而帶電荷多者，泳動(dòng)速度快；反之，則泳動(dòng)速度慢。因此可將血清蛋白質(zhì)依次分為清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五條區(qū)帶，經(jīng)染色可計(jì)算出各血清蛋白質(zhì)含量的百分?jǐn)?shù)。以醋酸纖維薄
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實(shí)驗(yàn)試劑TotalRNAKit：Omega：(Cat.No．R6834)FirstStrandcDNASynthesisKit：GeneCopoeia(Cat.No．C0210A)2xAllinOneTMQ-PCRMix：GeneCopoeia（cat.No．D0101A)Primersynthesis：invitrogen實(shí)驗(yàn)設(shè)備RealTimePCR：ABI實(shí)驗(yàn)材料樣品為5個(gè)人源的細(xì)胞培養(yǎng)液，其編號(hào)分別為：NO.I、No.2、No.3、No.4、No.5，其中為對(duì)照組，其它四個(gè)為不同的樣品組
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實(shí)驗(yàn)原理1.DNA段回收方法：DN片段在適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進(jìn)行電泳，不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DN片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。2.利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以把PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)，可用于PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。實(shí)驗(yàn)試劑1.pMDTM18-TSimpleVectorKit(Takara公司)2.
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實(shí)驗(yàn)步驟首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)，再次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：1．引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-27bp。2．引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。3．引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增
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大腸桿菌亮氨酞-tRNA合成酶的E292對(duì)氨基酞化活性的作用
實(shí)驗(yàn)試劑1.L-Leucine，ATP，DTT，焦磷酸鈉(tetrasodiumpyrophosphate)和HA-Ultrogel購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。2.[32p]-焦磷酸鈉購(gòu)自美國(guó)杜邦公司。3.L-[I4C]-亮氨酸和DEAE-SepharoseTMFastFlow購(gòu)自英國(guó)Amersham公司。4.限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購(gòu)自立陶宛MBIFerments公司。5.質(zhì)粒pTrc-99B。實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌LeuRS從高表達(dá)大腸桿菌菌株中純化得到實(shí)驗(yàn)步驟1.突變體LeuRS基因的構(gòu)建以構(gòu) -
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