本文要點：光動力療法（PDT）因其非侵入性和高選擇性而成為一種有前途的腫瘤治療方法。然而，光毒性的脫靶激活和腫瘤特異性生物標志物的有限可用性等問題使PDT存在局限性 。本文介紹了一種新型比率型近紅外二區（NIR-II）熒光有機納米探針BTz-IC@IR1061，該探針對腫瘤內的次氯酸鹽（HClO）有特異性反應。這種納米探針通過比例熒光成像來監測和指導腫瘤活化PDT。BTz-IC@IR1061納米顆粒是將產生活性氧（ROS）的小分子染料BTz-IC與商業染料IR1061共摻雜來合成的。利用HClO可選擇性地激活 BTz-IC 的熒光和光動力特性，同時破壞 IR1061，從而控制 ROS 的釋放用于腫瘤治療。本文研究證明了納米探針對HClO的高選擇性，同時具有優異的光穩定性、光聲成像能力和光熱能力。此外，體內研究顯示，通過腫瘤激活的光動力療法，可以有效靶向腫瘤并顯著抑制腫瘤生長。研究結果表明 BTz-IC@IR1061 在腫瘤特異性光動力療法方面具有潛力，為精準和可控的癌癥治療提供了新的機會。

動物活體成像

方案1. 比率NIR-II FL成像引導激活PDT癌癥治療的示意圖

在這項研究中，構建了一種新型比率型近紅外二區（NIR-II） 熒光 （FL） 有機納米探針 （BTz-IC@IR1061），該探針對腫瘤內的 HClO 有反應 （方案1)。該納米探針實現了比率 FL 變化和 PDT 激活，PDT 的激活通過比例 NIR-II FL 變化進行監測。納米探針由兩個主要成分組成。成分是有機小分子染料BTz-IC，它通過在傳統供體-受體-供體（D-A'-D）核心的兩端引入兩個受體基團，擴展共軛系統以實現NIR-II FL 發射。在光照射下，BTz-IC分子產生羥基自由基（·OH）和單線態氧（1O2）通過I型和II型光動力過程。第二種成分是商業花青染料IR1061。當兩個分子共摻雜時，觀察到兩個分子之間的熒光共振能量轉移（FRET），BTz-IC的光動力性能也被淬滅。與HClO一起孵育后破壞了IR1061，恢復了BTz-IC分子的熒光和光動力特性。PDT后，腫瘤部位發生炎癥，導致腫瘤內中性粒細胞浸潤，HClO濃度升高，進而導致IR1061的破壞和腫瘤中比熒光和PDT的激活。最后，比率NIR-II熒光探針可以監測活化PDT治療腫瘤過程。

圖 1. BTz-IC分子的合成路線和表征

BTz-IC分子的合成方法如圖1a所示。紫外和可見分光光度法（UV-vis）吸收光譜表明，BTz-IC分子在730 nm處有一個特征吸收峰（圖1c）。此外，熒光光譜顯示BTz-IC分子在850 nm至1100 nm范圍內有強烈的發射（圖1d）。此外，IR1061的吸收光譜范圍為800nm至1100nm，與BTz-IC的熒光發射范圍重疊（圖1e）。因此，兩個分子之間的FRET可以淬滅BTz-IC的熒光。為了進一步研究，使用表面活性劑DSPE-mPEG將這兩個小有機分子組裝成納米粒子（圖1b）。

最終使用的5:3比例合成了納米探針，并對其形態進行了表征。透射電子顯微鏡（TEM）圖像BTz-IC@IR1061展示了尺寸為31nm的對稱球形納米粒子（圖1h）。此外，BTz-IC@IR1061納米粒子表現出高水溶性，動態光散射（DLS）尺寸約為38 nm（圖1 g）。TEM和DLS尺寸一致。與此同時BTz-IC@IR1061在不同時間的不同溶劑（H2O、1640細胞培養基、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS））中沒有顯著變化，表明顆粒具有良好的穩定性。此外，測得的ζ電位為-25.1 mV。

圖2. BTz-IC@IR1061納米顆粒表征

通過用表面活性劑共摻雜這兩個分子來合成BTz-IC@IR1061在納米顆粒中，發生了FRET，淬滅了BTz-IC分子的熒光和光動力特性。在與ClO—孵育后，IR1061被破壞，從而恢復了BTz-IC分子的熒光和光動力特性（圖2a）。為了驗證納米探針對ClO—的特異性響應，本文對探針的選擇性進行了研究。選擇了腫瘤中幾種常見且高表達的分析底物，即谷胱甘肽（GSH）、H2O2、1O2、O2·?、·OH和ClO—。納米探針分別與這些分析物一起孵育，如圖2b所示，添加其他底物（GSH、H2O2、1O2、O2·?、·OH）后，1064 nm處的吸收變化可以忽略不計。相比之下，隨著ClO—的加入，1064 nm處的吸收顯著降低。此外，在ClO—響應前后測試了納米粒子的粒徑。在ClO—反應后，納米粒子的大小沒有變化，這有效地表明只有IR1061被破壞了。通過NIR-II熒光研究了選擇性，如圖2c所示。在與GSH、H2O2、1O2、O2·?、·OH充分反應后，808 nm和1064 nm激發的熒光保持不變。相反，當與ClO—反應時，由于IR1061的破壞導致FRET停止，808 nm激發的熒光增加，而1064 nm激發的熒光減少。此外，計算不同ROS反應前后808 nm/1064 nm激發的熒光比表明，添加ClO—后的熒光比為0.94，而GSH、H2O2、1O2、O2·?、·OH和水的熒光比分別為0.32、0.29、0.30、0.31、0.32和0.32?？傊珺Tz-IC@IR1061僅對ClO—顯示出高選擇性（圖2d）。

在研究了納米探針的選擇性后，研究者開始驗證BTz-IC@IR1061納米粒子在不同濃度ClO—下的反應。將納米探針置于不同濃度的ClO—中，并測量其吸收和熒光。隨著ClO—濃度的增加，808 nm處的吸收保持不變，而1064 nm處的吸光逐漸降低。這一趨勢表明，盡管內部參考分子BTz-IC不受影響，但IR1061逐漸被破壞。ClO—的檢測限為0.62μmol/L（圖2e）。此外，如圖2f和g所示，隨著ClO?濃度的增加，808 nm激發下的熒光增加，而1064 nm激發下的熒光減少。計算不同ClO?濃度下808 nm/1064 nm的熒光比，結果顯示，在20 μmol/L濃度下，熒光比高達123.25，而在0 μmol/L濃度時，熒光比為0.13（圖2h）?？傊撎结槍lO—表現出優異的檢測性能，并顯示出體內研究的潛力。

圖3. NIR-II熒光成像監測ClO—活化PDT

接下來，研究了ClO—激活BTz-IC@IR1061納米粒子進行光動力療法的性能，以驗證光動力療法的激活是否可以通過比率熒光監測（圖3a）。通過使用不同濃度的ClO—與5:3的BTz-IC與IR1061反應，驗證了PDT的激活（圖3b和c）。在808 nm激光照射30秒后，1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）在415 nm處的吸收隨著ClO—濃度的增加而顯著降低。這一結果歸因于隨著ClO—濃度的增加，納米探針之間的FRET受到更嚴重的破壞，導致BTz-IC分子的光動力恢復并增強。此外，計算了照射30秒后415nm處的吸收（At）與照射前的吸收（A0）之比（At/A0）（圖3d）。在ClO—濃度為20 μmol/L時，該比值為0.591，而在0μmol/L ClO—時，該比率為0.879，表明ClO—反應后PDT激活。

根據DPBF檢測到的ROS吸收變化，即使在極低激光照射條件（0.1 W/cm2）下照射10 s，415 nm處的峰值也急劇下降。這一觀察結果表明在分子的PDT過程中產生了大量的ROS，能夠通過I型光動力學過程生成·OH等自由基，通過II型光動力學過程生成1O2。以5,5-二甲基-1-吡咯烷N-氧化物（DMPO）和4-氧代-2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）分別作為·OH和1O2的捕獲劑，通過電子自旋共振（ESR）證實了這一點。在光照射下，出現了TEMP/1O2加合物和DMPO/·OH加合物的特征共振信號峰，表明納米探針能夠同時生成·OH和1O2（圖3e和f）。此外，在水中加入 ClO? 進行激光照射不會引起捕獲劑的特征峰出現，表明 ClO? 反應后 PDT 的激活不涉及 ClO? 與捕獲劑的反應。因此，納米探針表現出優異的 ClO? 激活 PDT 和熒光性能的恢復，這是由于 BTz-IC 和 IR1061 之間的FRET 被破壞所致。

對納米探針 BTz-IC@IR1061 的光穩定性進行了檢測，即使在用 808 nm 激光照射 16 分鐘后，納米探針的紫外光譜仍保持不變，表明其具有良好的光穩定性（圖 3g）。

此外，還研究了納米探針的光聲成像和光熱能力。納米探針在暴露于 808 nm 光時會產生熱量，與 ClO? 孵育后其光熱性能不受影響。此外，納米探針還表現出光聲成像能力，光譜中具有 BTz-IC和 IR1061 的特征峰（圖 3h 和 i）。這些發現為進一步研究在細胞和體內水平上使用納米探針對腫瘤進行成像和治療奠定了基礎。

圖4. BTz-IC@IR1061NPs不同時間兩個通道的NIR II熒光圖像（808 nm，Em>900 nm；1064 nm，Em>1100 nm）

BTz-IC@IR1061 納米探針在 ClO? 激活的 PDT 中表現出良好的特性，表現出優異的光穩定性、光聲成像、光熱效應以及產生 ROS 殺死癌細胞的能力。這些發現支持了納米探針在腫瘤 PDT 中的潛在應用。

在驗證了納米探針在溶液和細胞中均表現出顯著的 PDT 特性后，對癌癥的體內成像進行研究。研究者在 4T1 腫瘤小鼠模型中檢查了 BTz-IC@IR1061 的腫瘤富集效果。在患有皮下 4T1 腫瘤的 BALB/c 小鼠中靜脈注射 200 μL BTz-IC@IR1061 納米粒子（2 mg/mL），并在不同時間點捕獲光聲和 NIR 熒光圖像。腫瘤部位的光聲亮度隨時間逐漸增加，在注射后 8 小時達到峰值。此外，使用NIR-II熒光成像設備收集了通過靜脈注射納米粒子的小鼠熒光圖像。這些圖像顯示在808 nm和1064 nm激發下腫瘤區域的高對比度逐漸增強（圖4a），同時NIR-II熒光信號隨時間增加。值得注意的是，兩個激發通道中的熒光強度均隨時間增加。具體而言，在808 nm激發下，腫瘤區域的熒光在4小時時達到蕞大值，而在1064 nm激發下，熒光強度呈現初始增加，然后降低，然后再次增加的模式。此外，在靜脈注射納米粒子4小時后，腫瘤區域的熒光在808 nm處達到蕞大值，而1064 nm處的熒光蕞低（圖4b和c）。這項觀察表明，納米探針在最初到達腫瘤部位時，被腫瘤內存在的 ClO? 部分激活，隨著時間的推移，其腫瘤富集度增加，導致 1064 nm 處的熒光逐漸增加。來自腫瘤區域的可辨別的 NIR-II 熒光信號表明 BTz-IC@IR1061 納米粒子通過EPR 效應具有有效的腫瘤靶向能力。

患有 4T1 腫瘤（小鼠乳腺癌）的 BALB/c 小鼠瘤內注射 50 μL BTz-IC@IR1061 納米探針，30 分鐘后用 808 nm 激光照射7 分鐘（0.4 W/cm2）。圖 4d中所示的結果顯示，激光照射 1 小時后，1064 nm 處誘導的熒光與照射前水平相比逐漸降低，而 808 nm 處誘導的熒光則增加。相反，未接受激光照射的小鼠的熒光信號沒有顯著變化（圖4f 和 g）。將 808 nm 和 1064 nm 之間的熒光比標準化后，觀察到腫瘤照射 1 小時后熒光比增加了約 6 倍（圖 4e）。為了研究熒光比率變化的原因，使用了商業 Gr-1 熒光探針來評估照射后不同時間點腫瘤中的中性粒細胞表達。如圖 4h 所示，照射后不同時間間隔內組織切片中 Gr-1 的熒光逐漸增加，隨后降低。這種模式可能歸因于照射后腫瘤內的炎癥，導致中性粒細胞計數增加，熒光強度在 8 小時時達到峰值，隨后下降?，F有文獻表明，中性粒細胞計數的增加會促進腫瘤內 ClO? 濃度升高。因此，腫瘤內 ClO? 對 IR1061 的逐漸降解可能導致了熒光比率的變化。此外，熒光的變化可以激活 PDT，從而允許通過比率熒光的變化監測腫瘤治療。

對BTz-IC@IR1061 納米粒子評估其在小鼠中的治療效果。對患有4T1皮下腫瘤的BALB/c小鼠進行四種治療條件：（i）PBS；（ii）808nm激光；（iii）BTz-IC@IR1061納米粒子；（iv）BTz-IC@IR1061納米粒子+808nm激光。如圖5a中的時間線所示，在腫瘤內注射50μL BTz-IC@IR1061納米探針30分鐘后，對腫瘤進行7分鐘的預照射，一小時后進行第二次PDT治療。治療后每隔一天測量一次腫瘤體積。從腫瘤生長曲線可以看出，用BTz-IC@IR1061+808nm激光治療的小鼠表現出更強的抑制效果，治療14天后腫瘤消失。相反，對照組小鼠的腫瘤生長逐漸加?。▓D5b）。此外，治療14天后，各治療組小鼠體重均無明顯變化（圖5c），表明PDT對皮下腫瘤的有效性和生物安全性。治療24小時后，對腫瘤進行病理檢查。組（iv）腫瘤切片經蘇木精和伊紅（H&E）染色后，與其他組相比病理變化明顯，進一步證實了PDT對治療實體腫瘤的有效性（圖5d）。此外，治療14天后，主要器官未見明顯異常，表明該給藥方法具有很高的生物安全性（圖5e）。

圖5. 小鼠PDT治療

總之，本研究描述了一種新型比率型 NIR-II 熒光有機納米探針，該探針被命名為 BTz-IC@IR1061。該納米探針由具有 A-D-A'-D-A 共軛結構的有機小分子染料 BTz-IC 和商業染料 IR1061 組成。值得注意的是，BTz-IC 既可以通過 I 型光動力過程生成 ·OH，又可以通過 II 型光動力過程生成 1O2。當通過表面活性劑組裝成親水性納米顆粒時，兩種有機分子之間會發生 FRET，從而導致 BTz-IC 的熒光和光動力活性猝滅。當 IR1061 被 ClO? 破壞后，BTz-IC 的熒光和 PDT恢復，從而有利于比例 BTz-IC 熒光成像以監測 PDT。此外，PDT導致腫瘤部位中性粒細胞浸潤，隨后HClO濃度升高，進一步導致NIR-II熒光比例變化并激活PDT，此外，可以通過比例型NIR-II熒光變化來監測腫瘤PDT的治療情況。

參考文獻

Yin B, Liu X, Li Z, et al. Ratiometric NIR-II fluorescent organic nanoprobe for imaging and monitoring tumor-activated photodynamic therapy[J]. Chinese Chemical Letters, 2024: 110119.