本文要點：傳統的免疫探針具有從可見光到近紅外（NIR-I，650-900 nm）區域的吸收能力。近紅外二區（NIR-II，1000-1700 nm）窗口由于更深的穿透深度和可視化而引起了很多關注。本文報道一種基于人源納米抗體的免疫熒光探針（ICGM-n501）設計與合成，實現了shou次通過抗原增強熒光發射的NIR-II生物成像。通過將ICG類似物（ICGM，馬來酰亞胺修飾）與腫瘤特異性的n501進行定點偶聯，ICGM-n501以高分辨率（0.21 mm）實時監測基于抗體的生物制劑的腹部運輸途徑，在腹膜轉移瘤的生物成像中以更低的劑量（0.21μmol·kg?1）呈現比生物發光劑D-熒光素更好的準確性。在這項工作中，ICGM-n501展示了在臨床手術指導中的潛力，提供了下一代免疫測定生物制劑的模板。近紅外二區小動物熒光活體成像系統-MARS

n501被設計為用于抗體-藥物偶聯物和診斷試劑的功能性小分子的載體。作者先前基于非免疫健康供體的外周B細胞創建了一個大型Fab噬菌體展示抗體庫，并將篩選出的n501作為5T4靶向納米體。其中一個位于功能區外的半胱氨酸殘基用于特定藥物偶聯，該位點不會對該納米體（n501）的功能造成干擾。SDS-PAGE得到了均勻綠色溶液（產量ICGM-n501 = 44.8%）（Figure 1D）。HPLC結果（Figure 1E）顯示，ICGM-n501有較小的分子量（~501KDa），保留時間（10.65 min）與n501（10.64 min）相似，表明所得樣品是穩定且均勻的溶液。同時在無TCEP（穩定劑）的PBS溶液中觀察到n501的聚集和解離，表明ICGM的引入增強了n501結構的穩定性。

圖1. ICGM-n501的設計、應用和特性。（A） ICGM、n501及其共軛產物ICGM-n501的結構示意圖。（B–C）NIR-II生物成像系統和轉移瘤時變生物成像過程的圖示。（D） n501和ICGM-n501的SDS-PAGE（考馬斯亮藍染色）。（E） 不含穩定劑TCEP、1 mM TCEP和純化產物ICGM-n501的n501的HPLC光譜。（F） 歸一化NIR-I和NIR-II（插圖）ICGM-n501（0.6μM）的熒光發射光譜以及紫外-可見吸收光譜。NIR-II熒光光譜收集波長為980 nm 長通濾波器。

本文選用5T4抗原作為轉移瘤的靶標。n501（1 mM TCEP; IC50 = 0.54μM）和ICGM-n501（1 mM TCEP; IC50 = 0.22μM）顯示出與抗原5T4的良好結合親和力，而沒有TCEP穩定的n501由于聚集而顯示低親和力（Figure 2A）。相比之下，ICGM、不相關的免疫試劑ICGM-TH（ICGM修飾的抗酪氨酸羥化酶單克隆抗體）和n118（靶向CD16a）即使在高濃度下也表現出低親和力。這說明ICGM本身在抗原抗體結合過程中沒有影響。ICGM-n501與5T4表達細胞的特異性親和力通過流式細胞術測定評估。如Figure 2C所示，5T4抗原在卵巢癌PA-1和SKOV-3細胞系以及人腎上皮293 T細胞系中高表達，而在4T1細胞系中沒有表達。當測試這些細胞系對 ICGM-n501 的攝取時（Figure 2C），卵巢癌 SKOV-3（3.8）和 PA-1（9.73）細胞系都呈現出相對較高的熒光強度。

高純度的ICGM-n501促進了結合機理的研究。添加5T4抗原后，作者shou次在NIR-II區域觀察到ICGM-n501的特定熒光發射增強（Figure 2D），1050 nm處的熒光強度呈現出的非線性遞增曲線（Figure 2D（插圖））。將無關抗原s IL-15Rβ, gp140, mesothelin, Tim3- ecd, VEGF分別加入到含有ICGM-n501和飽和5T4抗原（0.267 μmol·L?1）的比色皿中（Figure 2D）,相應的熒光發射光譜幾乎保持不變，1050 nm處的熒光發射強度保持不變，表明ICGM-n501和5T4之間存在特定的連接。然而，在沒有5T4抗原的情況下，ICGM-n501的熒光光譜存在很大差異（Figure 2E）。

圖2. ICGM-n501的體外生物特性。（A） 基于含或不含TCEP、ICGM-n501、ICGM、ICGM的n501的ELISA數據的結合能力評估將濃度梯度稀釋至5T4抗原、H7N9 HA抗原的免疫劑TH-ICGM和N118作為陰性對照。誤差條反映了標準差（SD）。（B） 通過流式細胞術分析5T4抗原在不同細胞系（4T1、SKOV-3、PA-1和293T；每孔1×106）中的表達抗體（5T4靶向抗體M603、無關抗體G12和PBS）結合能力評估。（C） 不同細胞對ICGM-n501（100 nM）的攝取量直線（4T1、SKOV-3、PA-1和293 T；每孔1×105），（D）ICGM-n501（0.532μmol L）的NIR-II熒光發射光譜? 1.)添加5T4抗原（4.45nmol L? 1/次），以及ICGM-n501在1050 nm處的5T4抗原濃度依賴性熒光強度（插圖）。（E） 熒光發射光譜添加IL-15Rβ、gp140、間皮素、Tim3 ecd和VEGF抗原（4.45 nmol L）后，飽和ICGM-n501結合5T4抗原? 1.). 插圖顯示熒光燈添加不同抗原后，在1050 nm處發射ICGM-n501。（E） 添加5T4、IL-15Rβ、gp140、間皮素、Tim3-ecd和VEGF抗原（4.45 nmol L? 1.). 插圖顯示了添加不同抗原后ICGM-n501在1050 nm處熒光發射變化的比率與僅ICGM-n501相比。使用980 nm長通濾波器收集NIR-II熒光光譜。

 現象的機制總結如下（Figure 3G）。n501與ICGM的共軛使2-4 Bond保持扭曲角度，以提高TICT過程的頻率并發射更長的波長。加強Bond 1也略微提升了量子產率。ICGM-n501與5T4抗原進一步在膜上結合產生固定排列，從而提高了膜上5T4抗原的J聚集概率。在此過程中，5T4抗原作為染料之間分子間能量轉移的固相發揮作用，從而促進了熒光發射強度以及波長的紅移。

圖3. 抗原促進熒光強度增強的機理分析。（A） 用于高斯計算的ICGM和ICGM cys的化學結構。（B） ICGM和ICGM CY的HOMOs和LUMOs。（C） 當鍵2扭轉0時，ICGM和ICGM-cys的靜電勢面（ESP）0°, 55°, 和90°. （D） ICGM和ICGM-cys發生的TICT（扭曲分子內電荷轉移）過程的圖示。（E） 藥物測試說明。（F） ICGM-n501（0.21μmol kg）后不同時間（30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時和48小時）血清中ICGM-n501的濃度? 1.)靜脈注射到健康小鼠。（G） ICGM-n501的詳細熒光增強過程說明。

應用皮下腫瘤模型評估 ICGM-n501 的腫瘤內通路。如Figure 4B、C 所示，通過腹腔注射0.21 μmol kg-1 ICGM-n501后成功地觀察到 ICGM-n501 的腫瘤通路。作為比較，基于D-熒光素的生物發光成像需要更多劑量。同時，ICGM-n501可以提供高分辨率（0.21 mm）圖像。直觀地觀察到ICGM-n501的腹腔內遞送途徑，并觀察到它通過各種類型的淋巴結吸收和轉運（Figure 4B）。在Figure 4F中，將不同時間（0 min、12 min和158 min）的 NIR-II 生物成像結果轉換為荷瘤小鼠的 3D 熒光強度統計模型，然后基于指示整個 NIR-II生物成像熒光強度的模型計算 2D 表面體積。2D熒光強度體積從0 min的184940（Figure 4F）增加到 371327（Figure 4G），最后在 926897（Figure 4H）結束。熒光強度隨著 ICGM-n501 進入腫瘤區域而飆升，這是直觀的證據表明ICGM-n501與5T4 抗原結合的作用促進了熒光發射的強度。與靜脈注射相比，ICGM-n501通過腹膜內注射進入血流的時間更長。158 min時，NIR-II熒光描繪的腫瘤形狀與基于D-熒光素生物發光的腫瘤形狀一致。切除腫瘤并H&E染色分析（Figure 4I），顯示與高斯2D擬合的腫瘤大小結果相似（9 mm×8 mm）（Figure 4H插圖）。綜上所述，ICGM-n501具有高分辨率和腫瘤靶向精確性。

圖4. 通過ICGM-n501和D-熒光素進行皮下腫瘤生物成像。（A） 給雌性裸鼠（9周）注射0.21μmol kg? 1 ICGM-n501之前注射后（B）0分鐘、（C）12分鐘和（D）158分鐘的布萊特菲爾德照片和腹部成像。還顯示了相應的三維統計結構和二維高斯擬合曲線計算（F–H）。同一只小鼠注射D-熒光素（670μmol kg? 1） 585–735 nm（E）下生物發光成像前20分鐘。在功率密度為2mw的情況下，使用1200 nm長通濾波器和808 nm激發激光進行NIR-II生物成像?厘米? 2.

腹膜轉移（PM）通常發生在患有腹部器官癌癥（如胃癌、卵巢癌、結腸直腸癌、闌尾癌和胰腺癌）的患者中，預后很差。因此，高精度靶向腹膜轉移至關重要。目前，靶向葉酸受體的OTL-38（3期）和EC-17（1期）是卵巢癌手術助手僅有的兩個臨床候選，假陽性率為32.7%。ICGM-n501將擴大目標類別和延長成像窗口。首先通過生物發光確定了腹膜轉移性腫瘤的位置（Figure 5A）。在Figure 5B中，腹部有七個明亮的圓形斑點，肝臟位置上方有另外兩個薄弱點。如Figure 5D所示，ICGM-n501的熒光強度較高，熒光狀區域呈不規則狀，與H&E染色呈現的腫瘤形狀一致（Figure 5H，5J-Q）。這些現象表明ICGM-n501在較低劑量 (0.21μmol·kg-1 ) 下顯示出更高的準確性，部分原因是ICGM-n501-5T4結合的顯著熒光增強。隱藏在器官中太深肉眼區分的腫瘤（Figure 5H）被ICGM-n501成功定位和描繪，但在wu創生物成像中D-熒光素卻達成目標。

圖5. 通過ICGM-n501和D-熒光素進行腹膜轉移瘤生物成像。將D-熒光素（670）腹腔注射給一只裸鼠（約9周）μmol kg? 1） 在近紅外生物成像儀上以585–735 nm注入后20分鐘，在亮場照片（A）和生物成像（B）之前。顯示了相應的2D熒光強度統計圖（F）。同一只小鼠靜脈注射ICGM-n501（0.21μmol kg? 1） 注射后46分鐘，在brightfield photo（C）和NIR-II生物成像（D）之前。相應的2D熒光強度統計映射如（I）所示。（E） D-熒光素和ICGM-n501的結構、外觀和劑量說明。（G） 腹部開放的小鼠的亮場，腫瘤可見區域由橙色虛線環繞。（H，J-Q）ICGM  n501基于生物成像的組織切除和相應的免疫組化分析。在功率密度為2 mw的情況下，使用1200 nm長通濾波器和808 nm激發激光進行NIR-II生物成像?厘米? 2.

本文報告用于NIR-II轉移性腫瘤生物成像的quan人類熒光免疫探針(ICGM n501)。憑借ICGM-n501的均質特性，shou次在體外和體內觀察到由特異性抗原抗體結合引起的顯著熒光發射增強，并推斷出TICT和J聚合涉及的兩步機制。ICGM-n501在皮下腫瘤模型中以高分辨率（0.21 mm）演示了基于抗體的生物制劑的淋巴轉運，以低劑量精確定位腹膜轉移性腫瘤中的微小病灶（1.38 mm）。總之，ICGM-n501 代表了一種強大的NIR-II生物成像劑、臨床轉移性腫瘤的診斷候選物和NIR-II 免疫探針的多功能設計模式。

參考文獻

doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121637

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近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

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熒光壽命 - 分辨率優于 5us

高速采集 - 速度優于1000fps （幀每秒）

多模態系統 - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區高分辨顯微系統，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

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