樹枝狀聚合物(dendritic Ploymers, dendrimer)由于其*的結構和物理化學性質在聚合物學科領域引起人們廣泛關注, 并在近40多年蓬勃發展.樹枝狀聚合物是繼線形、支鏈形和交聯聚合物以后新發展的第四類聚合物, 包括樹枝分子(dendrimer)和超支化聚合物(Hyperbranched polymer).樹枝形聚合物具有的納米構造, 其的層數與體積可由合成步驟決定.此類聚合物一般通過AB2, A2+B, A2+B'B2, 自縮合乙烯基聚合(SCVP)及自由基聚合等方法共價合成.樹枝形分子是通過縮聚反應得到的, 需嚴格控制反應過程使其結構具有*的對稱性, 從而得到狀態的樹枝狀結構的分子.但這類樹枝狀化合物的制備和純化具有一定的困難, 因而限制了其廣泛的發展應用.超支化聚合物的結構不要求很, 具有一定的相對分子質量分布, 并且與樹枝形分子相似, 一般可采用一鍋法來合成, 所以易于產業化生產.近部分研究者已經開始通過超分子化學的方法來合成具有不同拓撲結構的樹枝狀聚合物, 這類聚合物由于具有無尺寸限制、可大量生產且重復性好、價格低、使用簡單方便、易于修飾等優點而受到廣泛關注.自20世紀80年代以來, 樹枝狀聚合物的合成方法由初的發散法發展出收斂法、發散收斂共用法以及固相合成法等多種合成方法.

非病毒載體包括樹枝狀聚合物、多肽類、多糖類、脂質體、陽離子聚合物和無機納米顆粒.它們由于安全、易于制備、成本低而被廣泛應用.早期的病毒類基因載體存在較多缺陷如轉載能力小、耐反復感染、難以進行生產和質量控制以及安全性低等.而非病毒基因治療的出現, 可以克服病毒載體的種種限制.但是很多非病毒基因載體自身的生物毒性和低的生物降解性阻礙了它們的發展.因此缺乏低毒的基因運送載體成為基因治療的主要障礙.大多數的陽離子樹枝狀聚合物包括聚賴氨酸和聚乙烯亞胺, 雖然能夠獲得較高的轉載率, 但是卻難以避免地對細胞產生較大的毒性, 使得其臨床應用受阻.

基因治療是指將外源性的DNA, RNA用于治療后天獲得性疾病, 該方法已經被廣泛應用于臨床試驗.基因治療是*的用于治療后天以及先天性疾病(如艾滋病、癌癥、基因紊亂等疾病)具發展潛力的治療方法.在基因治療中只有一個問題需要解決:基因的輸送.輸送基因的載體可分為病毒和非病毒載體.病毒載體由于破壞其自身自然的感染體系易引起變異, 盡管事例證明它很有效, 但是其存在的安全隱患即免疫原性以及可能的基因重組等都限制了其應用.

樹枝狀聚合物具有得天獨厚的分子特征(三維立體結構)和物理化學性質, 因此被廣泛地應用于構建多種聚合物材料、納米藥物、生物材料等.特別是在抗癌基因載體中起到很好的抗癌治療效果, 表現在與DNA/ RNA分子的偶聯及與抗癌藥物分子的結合.樹枝狀聚合物可以通過修飾得到不同功能響應型樹枝狀聚合物基因載體, 并可以和多種有機大分子、無機材料復合形成多功能基因載體.該類分子所形成的基因載體也逐漸成為非病毒載體中的重要成員.本文以四個章節分別介紹了樹枝狀聚合物材料、有機無機化合物結合的載體材料、超分子母體材料結合的載體材料和功能響應性載體等材料.

1 樹枝狀及其衍生材料

與PEI超支化分子相同, PAMAM樹枝高分子不僅可以轉載基因, 并且氨基官能團可以結合藥物分子組成嵌段化合物, 此外其本身也具有熒光.但該大分子的生物毒性限制了其在藥物基因轉載上的應用. PAMAM樹枝狀高分子通過共軛萘酰亞胺基團的取代反應進行改性, 如它結合殼聚糖(CTS)后主鏈共軛物的水溶性增加, 并且可與質粒DNA復合形成球形顆粒. CTS-PAMAM的共軛/質粒DNA復合物的轉染效率明顯高于未改性的殼聚糖和PEI, 同時具有較低的N/P(樹枝狀分子中的一級胺和二級胺/DNA或者RNA中的磷酸比值).同時研究人員對合成的CTS-PAMAM復合物進行DNA的絡合, 體外細胞毒性, 體外轉染HeLa細胞(子宮頸癌細胞)和血液相容性進行了研究.結果表明, 殼聚糖改性后的樹枝狀共軛物即使在高濃度(300 mg/mL)也表現出優異的DNA復合性, 低毒性以及血液相容性.后期他們發現N-酰化殼聚糖修飾的PAMAM也表現較好的轉染.因此殼聚糖分子的共軛樹枝狀分子CTS-PAMAM可用作安全的非病毒基因載體.

官能團的修飾同樣可以增加PEI基因載體的靶向性, Li等報道的含功能性官能團的PEI實現了基因的定向轉載.他們利用經油酸修飾的吐溫85, 經過琥珀酸酐開環形成羧基化吐溫85, 然后將其與低分子量PEI(分子量為2000)縮合形成兩親性的二元復合大分子, 該復合物與pDNA自組裝形成新型基因載體TP.小分子PEI的毒性較低, 并具有較高的轉載效率.脂質層的存在為正電荷的PEI-DNA復合物的內核提供了一個電荷屏蔽外延.實驗表明, TP是安全有效的基因載體, 特別是在大量表達的低密度脂蛋白受體細胞中的使用, 如HT29-DX細胞(人結腸癌細胞株)、A549的DX細胞(肺癌細胞系)及HepG2細胞(肝癌組織)等.

陽離子聚合物/DNA復合物很容易在人血清中沉降, 被各種生物酶分解, 如何提高其血清的抵抗力、生物可降解性以及無毒轉染機制備受科學家關注. Zhang等合成了以PPI二代樹枝高分子為核心的MP-G-PPI多臂基因載體(圖 6).作者利用內核PPI上的氨基修飾上聚(L-谷氨酸)(PLG)后, 再接枝低代PPI (G1.0或G2.0)形成環繞式多臂支鏈.由于PLG支臂可生物降解且毒性低, 而且PPI球狀結構外圍的小分子PPI可以很好地保護壓縮DNA, 因此應用其轉染DNA進行基因治療也取得了很好的效果.該類載體的電勢(zeta potentials)可達到42～44 mV, 這種聚合物能夠與質粒DNA復合從而得到穩定的帶正電荷的粒徑為111～219 nm的納米顆粒.用透射電子顯微鏡(TEM)可觀察到MP-G1.0 PPI/ pDNA相互作用形成的球形顆粒狀復合物.對比不同分子量和不同PEI載體結構的轉染siRNA基因治療, 結果表明其達到了Lipofectamine 2000 (L2k)同等的效果.

利用天然氨基酸作為樹枝狀分子的單體不僅充分了利用天然氨基酸的優點, 并且合成的樹枝狀載體毒副作用小. Helena等報道了樹枝狀聚酰胺-胺(PAMAM)結合RGD短肽Arg-Gly-Asp(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的新型基因載體.聚酰胺-胺六代樹枝狀分子經修飾后可控制結合上4個、8個、16個多肽單元(圖 11). RGD多肽在細胞表面作為纖維連接蛋白受體可以提高基因轉載效率.實驗證明質粒DNA可以通過RGD中間介導與細胞表面的負電荷發生非特異性靜電反應進入骨髓間充質干細胞. Khuloud等利用新型第六代陽離子水溶性聚L-賴氨酸樹枝狀化大分子poly(L-ly-sine)(分子量8149000)與疏水性化療藥物阿霉素絡合, 增加了親脂性抗癌類藥物的滲透性和轉載效率.而且這個復合物在單層細胞組織、多細胞腫瘤球體(MTS)以及活體腫瘤細胞里都展現了比單獨抗癌藥更好的滲透性.總的來說, 利用抗血管增生的超支化聚合物基因載體可以提供一個合理的抗血管生成和腫瘤體內化療的組合療法.

由于硅原子的特殊性質, 與其他的樹枝狀高分子相比, 含硅的樹枝狀高分子具有顯著的多樣性, 同時具有含硅化合物的許多優異性能, 如低的玻璃化溫度、低的表面能等.根據不同的生物應用, 可將適當的官能團鍵接于有機硅樹枝狀高分子上, 賦予了樹枝狀高分子新的功能.研究表明碳硅烷超支化分子可以很好地轉載釋放寡核苷酸(ODNs)與小片段干擾核糖核酸(siRNA). Martínez等利用酞酰亞胺為起始原料合成了不同支化代數的碳硅烷樹枝高分子, 并且在大分子外圍進行氨基甲基化修飾(圖 8).研究表明樹枝狀化合物表面帶有正電荷的氨基或季銨鹽具有抗菌活性.然后將合成的陽離子三代碳硅烷超支化分子修飾在介孔二氧化硅(MSNs)上, 并且可以利用二氧化硅的孔徑吸附相關藥物分子.該類基因載體在轉染ODNs過程中不影響細胞存活率, 生物毒性很小.實驗表明, 其在人骨肉瘤細胞(HOS cell)的24 h內DNA轉載率可達到84%, 成功取得了臨床基因治療效果.

Polyethyleneimine (PEI)是一類典型的基因載體, 它被廣泛應用于脫氧核糖核酸(DNA)、小片段干擾核糖核酸(siRNA)以及反式寡聚脫氧核苷酸(ODN)的轉導, 并表現出*的轉導效率. PEI的正電荷起到質子海綿體的作用并且對DNA有較好的保護.但同時也因為其內在的生物毒性、與體內細胞組織、血液細胞中沒有特定靶向性, 并且在血清蛋白中會自聚合, 從而限制了其在生物體內的應用.為了提高PEI的生物靶向性降低其生物毒性, 科學家將PEI與多種分子(脂質體、聚合物、生物活性分子等)結合.引入靶向分子可以有效提高基因的靶向傳遞, 實現靶向細胞的選擇性轉染. Carsten等報道的超支化PEI自組裝的二元或三元復合物(比如PEI-pDNA-INS)可以提高肺泡上皮細胞的基因傳遞和表達(圖 2).他們利用超支化PEI與質粒脫氧核糖核酸自組裝成復合物粒子, 將人胰島素(INS)以非共價鍵吸附在二元復合物納米粒子上, 由于肺泡支氣管上皮細胞中胰島素受體較多, 從而達到定向轉載基因并且增加基因表達的目的; 同時胰島素包覆后可以降低三元復合物的生物毒性.由此自組裝形成的三元PEI-pDNA-INS目標復合物為肺泡上皮細胞的后天獲得性和遺傳肺部疾病提供了新療法.

超支化聚合物與樹枝高分子相同, 具有豐富的末端官能團、三維空間結構和分子內部空穴結構, 并且在基因轉染方面展現著優異的性能.但它在合成和純化方面有著顯著的優勢, 如制備簡單、可規模化生產. Wang等報道了超支化聚酰胺胺(PAAs)應用于基因輸送體系.作者通過一鍋法邁克爾加成聚合, 以N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺和1-(2-胺乙基)piperazine為反應單體, 通過控制反應液H2O/DMF的比例得到了支化度為0.06～0.44、數均分子量為8300～9320的超支化聚酰胺(圖 3).通過對超支化高分子支化度的控制而調整其質子緩沖能力、生物毒性以及壓縮pDNA的能力.實驗結果顯示聚合物/質粒DNA的復合物可以進入細胞, 并且聚合物載體在轉染過程中停留在細胞質內.后期他們利用N, N'-雙(丙稀酰)胱胺代替單體N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺合成了氧化還原響應型的超支化基因載體.

利用天然氨基酸組成的多肽同樣可用于基因載體, 并且多肽倍廣泛應用于在特定組織及細胞內的基因靶向/定向轉導. Bayele等合成了以疏水性脂肽為核心, 外圍修飾帶正電荷賴氨酸的雙功能超支化分子非病毒基因載體.脂肽結構的*性、合成可控性和特異性以及它們的多功能性和廣泛的修飾性, 使他們成為新的一類超支化高分子基因載體.該小組對脂肽的末端賴氨酸進行修飾, 從而形成內核疏水外圍親水的超支化載體.實驗表明, 肽的超支化分子可以在體外干擾熒光酶的RNA的表達.同時在肽基礎上將超支化高分子與抗癌藥物結合, 可以增加抗癌脂溶性藥物在體內的吸收.

近年來基于陽離子聚合物的非病毒轉基因載體已經取得了備受矚目的進展.多種陽離子樹枝狀聚合物分子被應用于基因轉載的研究中, 本文主要側重于介紹支化聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)、超支化聚酰胺胺[poly(amido amine)s, PAAs)]、聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(polyamidoamine, PAMAM)、聚L-賴氨酸樹枝狀化大分子[poly(L-lysine), PLL]、聚(醚亞胺)樹枝狀高分子(PETIM)、聚丙烯胺樹枝狀高分子(polypropyleneimine, PPI)、三嗪類樹枝高分子(triazine dendrimers)、碳硅烷樹枝狀高分子(carbosilane dendrimers)、磷化樹枝高分子(phosphorus dendrimers)、紫精樹枝高分子(viologen dendrimers, VGD)以及基于氨基酸及其多肽構建的樹枝狀聚合物.此類聚合物擁有特殊的結構及納米尺寸, 并且在外圍有大量的官能修飾位點.該類聚合物結構具有豐富的可修飾功能基團, 提供載體的功能化和智能化修飾的可能, 因此被應用于基因載體材料.利用樹枝狀聚合物的大量外圍官能團進行改性, 構建優良性狀的陽離子聚合物, 實現基因分子的轉載.氨基載量高的正電荷樹枝高分子與脫氧核糖核酸/核糖核酸的磷酸基負離子結合, 將伸展的雙鏈DNA/RNA分子壓縮成納米小球.此種復合可以保護DNA/RNA分子在細胞內的分解, 利于細胞內吞及其基因的釋放(圖 1).

紫精(N-取代的4, 4'-聯吡啶季銨鹽)具有優良的氧化還原可逆性及特殊的光電化學性能, 因此在光電轉換、光致變色、電致變色材料等方面有廣泛的應用. Li等合成了一系列的紫精樹枝高分子(VGD), 分別利用甲基、乙基以及胸腺嘧啶修飾, 并且對這些VCD在基因轉染上的進行研究(圖 10).實驗表明增加紫精樹枝分子重量和正電荷的數量可以提高DNA轉染效率和CXCR4拮抗作用, 然而, 較高的分子量同時也增加了細胞毒性.因此, 實驗表明低支化代的VGD (G1, G2)擁有作為趨化因子受體(CXCR4)拮抗劑和基因載體雙重功能.這種雙功能基因載體在CXCR4基因治療中有突出的效果, 適用于包括癌癥轉移、HIV感染和多種炎性疾病, 為未來基因治療提供了可能.

對樹枝狀分子外圍的整體修飾可以更大范圍地實現樹枝高分子的改性. Narayanaswamy等報道非病毒載體可以在分子水平進行修飾, 由此可得到基因載體.他們報道了可以進行有效基因轉載的聚(醚亞胺)(PETIM)樹枝狀高分子(圖 4).利用叔胺化合物為骨架分支點, 將正丙醚連接在它們的周邊, 然后再利用伯胺分子進行末端修飾合成PETIM樹枝狀高分子.電子顯微鏡圖顯示, pEGFP-C1-PETIM聚合物在對乳倉鼠腎細胞(BHK-21)進行轉染8 h后, 在細胞核膜外部以及細胞核內均有聚合物的存在, 有力證明了PETIM-pEGFP-C1聚合物可以轉染到細胞漿中, 并且可以很好脫離內涵體進行基因轉染.實驗表明PETIM在很寬的濃度范圍均顯示較低的生物毒性; 并且它可以有效壓縮質粒DNA, 保護DNA免受來自內涵體的損害, 從而把轉載的DNA安全輸送到到細胞核內.

磷化樹枝狀分子具備其他陽離子沒有的熱穩定性(高達250 ℃), 并且在水中具有的酸堿穩定性(pH從3到12)以及樹枝分子空間靈活性.正是由于磷化樹枝狀分子的特殊性質使其得到廣泛的應用. Loup等通過連續控制片段分子H2N-N(Me)-P(S)Cl2的生長得到了五代磷化樹枝高分子.后通過對末端三級胺的甲基化修飾得到末端含96個胺基陽離子的五代磷化樹枝狀高分子(圖 9).實驗表明, 磷化樹枝化末端叔胺質子化樹枝分子在5 equiv.核苷酸下成功實現了對血清細胞中轉染熒光素酶基因的轉染.此外, 它們沒有毒性, 并且在水溶液中非常穩定.作者后期將進一步研究評價這些新樹枝狀高分子在體內轉染藥物的性能.

含三嗪骨架的高分子利用胍胺上氮可以與DNA上核酸堿基(胸腺嘧啶、尿嘧啶)形成相互交聯的氫鍵實現對基因的轉載.但是含三嗪骨架的高分子如聚(乙烯基三嗪4, 6-二氨-1, 3, 5-三嗪)基因載體的水溶解性差和轉導效率低等缺點使其在臨床應用中受到限制.而Wang等將三嗪分子通過簡單易行的方法修飾在樹枝分子PAMAM上, 形成水溶性三嗪類樹枝高分子(Triazine dendrimers)基因載體.三嗪修飾的樹狀大分子可以地將相關凋亡誘導配體基因(TRAIL, related apoptosis inducing ligand gene therapy)和增強功效蛋白(EGFP)的綠色熒光基因轉載到肉骨瘤細胞中(肉骨瘤MG-63細胞株).肉骨瘤是一種常在青少年中發展的惡性骨腫瘤.盡管近年來在治療水平上有所提高, 但是僅有的5年生存率讓患者的*降低很多.此類基因載體與TRAIL質粒進行復合, 對荷瘤小鼠進行注射治療, 對應的基因表達蛋白質含量明顯提高, 有效抑制腫瘤的生長, 腫瘤重量遠遠小于對照組, 達到基因治療的效果, 具有臨床應用的價值, 有望成為該病變的治療手段. Shao等進一步通過表面修飾樹枝狀大分子PAMAM合成了一系列的表面富含胍胺分子2, 4-二氨-1, 3, 5-三嗪(DAT)的樹枝狀大分子(G5-DAT55), 并且所合成樹狀大分子具有顯著的轉染效果且細胞毒性低(圖 7).在非洲綠猴腎成纖維細胞(COS-7)中進行三維細胞培育, 結果表明, G5-DAT55在對EGFP基因轉染試驗中, 其效率優于代表性轉染試劑Lipo 2000和bPEI(分子量: 25 KD).并且G5-DAT55表現出更高的綠色熒光蛋白在3D細胞球內表達的能力.互補的多個氫改性配體與核酸堿基的鍵合作用在基因轉染的成功中起著至關重要的作用.氫鍵調制策略在陽離子聚合物應用非常廣泛, 在設計轉染和減少細胞毒性基因載體上有突出貢獻.后期他們將利用這一策略合成一系列率和低細胞毒性的高分子基因載體.

紫精樹枝高分子基因載體

聚L-賴氨酸樹枝狀化嵌段基因載體

聚丙烯胺樹枝狀基因載體

聚乙二醇PEG具有良好的水溶性, 并與許多有機物組分有良好的相溶性.正是由于PEG的優良兼容性使得聚乙二醇在陽離子聚合基因載體中得到廣泛應用. Tamara等報道了三嵌段聚合物即聚酰胺-胺和聚(乙二醇)-多聚賴氨酸(PAMAM-PEG-PLL)納米載體的設計、合成以及其轉導siRNA的研究(圖 5).該基因載體解決了細胞中siRNA轉導中難以被細胞攝取、易于被內涵體吞噬、易于降解等問題.三元復合物集三個聚合物的優點于一體: (1) 聚酰胺團樹枝狀高分子作為質子海綿在內涵體逃逸和在細胞質中運載siRNA發揮了至關重要的作用; (2) PEG作為連接分子穩定和保護血漿中的siRNA核酸; (3) 多聚賴氨酸(PLL)上的胺基陽離子可以通過靜電反應和帶負電的DNA結合.實驗結果表明PAMAM-PEG-PLL可以很好地與siRNA結合, 可以有效地被腫瘤細胞吸收, 并且可以誘導釋放siRNA上的靶向基因Bcl-2B(淋巴細胞瘤-2基因).

聚氨基酸基礎的基因載體

碳硅烷超支化基因載體

三嗪樹枝狀基因載體

2 與超分子母體材料結合的樹枝狀聚合物載體

除了天然環糊精構建的基因載體外, 很多人工合成的超分子母體材料也被應用其中, 并且具有尺寸可控, 自由度更大等優點.葫蘆脲分子是一種桶狀的環狀化合物.它的空腔是疏水的, 而且兩端開口, 空腔兩頭比較小、中間很大, 可以包結有機分子. Lim等報道的葫蘆脲(CB)是一個由6個甘脲單位的亞甲基橋相互作用組成的大籠狀化合物(圖 13).他們利用CB與PPI-DAB樹狀分子(1, 4-二氨基丁烷, 二聚)三代支化物以及DNA自組裝形成三元復合物. PPI-DAB和葫蘆脲(CB)被認定為一例*組裝的基因傳遞載體, CB與PPI-DAB通過多個共價鍵相互作用, DNA與PPI-DAB通過靜電內在反應生成三元復合物.動態光散射數據表明, 其粒徑的大小和分布在150～210 nm內.熒光結果表明三元絡合物中CB和PPI-DAB是定量結合的. PPI-DAB/CB復合物的細胞毒性相對較低并且能夠在哺乳動物細胞內轉染基因.

環糊精末端修飾的樹枝基因載體

環糊精(CD)是由多個D(+)-葡萄糖單元通過α-1, 4-糖苷鍵首尾相連而成的環狀化合物.正是由于CD具有“內疏水、外親水”的特殊空間結構, 使得環糊精得到廣泛的應用. Shreyas等報道了基于環糊精修飾的樹枝狀聚酰胺-胺的基因輸送體系(圖 12).通過三-(2-氨乙基)胺與丙烯酸甲酯為單體進行邁克爾加成聚合然后氨解后得到末端為48個氨基的樹枝狀聚酰胺-胺, 將此化合物與對甲苯磺酰化的β-環糊精反應得到環糊精修飾的樹枝狀分子聚合體, 實驗表明環糊精的增加有助于降低材料的毒性.同時環糊精樹枝狀聚酰胺-胺具有良好的質子緩沖能力, 能夠有效濃縮pDNA, 對外源性基因以及疏水性藥物分子均能進行轉載. Huang等利用修飾的PEG 2000與α-CD反應制備了聚輪烷, 再通過相應修飾形成的PPG1納米顆粒基因載體可與pDNA形成穩定的復合物膠體, 該PPG1超分子/質粒DNA復合物(約100 nm直徑)經過了256倍稀釋后還是非常穩定, 并且保持其初始尺寸和分布; 體外細胞實驗表明它在人胚腎細胞中運載pDNA主要通過小膠囊依賴的途徑, 而不是PEI(分子量為25 K)依賴網格蛋白途徑.

葫蘆脲超支化基因載體

超分子通常是指由兩種或兩種以上分子依靠分子間相互作用結合在一起, 組成復雜的、有組織的聚集體, 并保持一定的完整性使其具有明確的微觀結構和宏觀特性.與超分子母體材料結合樹枝狀聚合物得到的基因載體可以有效地降低生物毒性、提高轉染效率和增加靶向性, 合成該類智能型載體的方法包括改變立體結構、增加功能基團以及連接靶向分子等.尤其是利用分子識別能力和分子間超分子作用構建不同拓樸結構的智能基因載體越來越受到生物化學科學家的關注.

3 無機材料結合的樹枝狀聚合物載體

石墨烯具有良好的導電、導熱性以及電化學穩定性, 石墨烯材料被廣泛應用在電化學、生物化學以及材料化學中. Kim等通過修飾氧化石墨烯的官能團(GO)賦予其特定的功能或結構屬性(如易于控制合成、高水分散性、良好的膠體穩定性和生物相容性、可調的表面官能化等).因此它在生物醫學領域如生物分子成像、藥物基因載體和癌癥治療等方面吸引了越來越多的關注.他們以GO為基礎修飾上低分子量支化聚乙烯亞胺(BPEI, 一種低分子量陽離子基因載體, 它可提高與DNA結合率和轉染效率)形成了有效的基因載體(圖 15).細胞實驗證實了BPEI-GO具有較高的轉染效率和細胞活力.此外, GO的BPEI與GO之間的共軛效應也增強了GO的光致發光性能, 因此BPEI-GO可以作為生物體內的熒光試劑. Yang等進一步研究在GO上嫁接PAMAM大分子和鎵離子.在姜黃素對膠質瘤U87細胞轉載miRNA后可以進一步利用石墨烯作熒光共聚顯微鏡, 用于化療和核磁共振成像.這些實驗結果表明鎵偶聯的樹枝狀高分子-氧化石墨烯配合物可作為有效的非病毒基因載體應用于基因轉載和腫瘤的治療.

Holger等通過不同單體[如聚丙烯酸(PAA)]修飾一步法制備了表面包覆羧基的水溶性磁性納米顆粒(PAAIO).表面帶負電荷的磁性納米粒子可以很容易在水相中和支化聚乙烯亞胺結合.修飾上陽離子支化聚乙烯亞胺后的磁性載體可以與DNA結合(圖 16).由于PEI-PAAIO/pDNA較低的細胞毒性和良好的穩定性, 其作為基因載體和單獨的PEI和聚合物-磁性顆粒相比更加*.雖然在肽牛血清存在時其基因轉導的表達較低, 但當暴露在磁場中時, PEI-PAAIO/pDNA的基因轉染效率顯著增加. Pan等以8 nm的超順磁粒子為基礎, 制備了超順磁-五代聚酰胺-胺樹枝狀高分子復合物.該復合材料在細胞內表現出較高的轉染效率.這些結果表明, PAMAM支化分子修飾的超順磁性納米顆粒是很好的基因載體并在癌癥治療以及影像學診斷都有潛在應用.溶膠-凝膠法(Sol-Gel法)同樣用于超順磁-樹枝狀基因載體的合成. Gonzale等以共價鍵把PPI樹枝狀高分子接枝到磁赤鐵礦納米粒子(γ-Fe2O3納米顆粒)的表面.利用溶膠-凝膠法用烷氧基硅烷衍生物對鐵氧化物納米顆粒表面一步修飾上樹枝狀聚合物.溶膠-凝膠法合成的樹枝狀高分子的功能化的磁性納米粒子可以形成穩定的親水性膠體溶液.親水性磁性溶膠的合成有利于磁性納米粒子在生物醫學中應用.

納米金即指金的微小顆粒, 其直徑在1～100 nm, 具有高電子密度、介電特性和催化作用, 能與多種生物大分子結合, 且不影響其生物活性.引入靶向分子可以有效提高基因的靶向傳遞, 實現靶向細胞的選擇性轉染. Shi等報道了利用葉酸分子修飾后可作為靶向基因載體的金納米-支化粒子(Au DENPs-FA).它與質粒DNA可自組裝成聚合物, 凝膠阻滯實驗、動態光散射和Zeta電位實驗均表明其有效壓縮質粒DNA形成的復合物具有小尺寸且表面帶正電荷(圖 14). Au DENPs-FA的基因轉染實驗表明其可和特異地在Hela細胞上進行轉染熒光素酶基因(Luc), 并且可以增強綠色熒光蛋白(EGFP)基因的轉導. Shan等的工作表明金納米粒子可以維持樹枝狀高分子的模板, 剛性金納米粒子包覆在樹枝狀高分子的內部有助于保護樹枝狀分子的樹枝狀三維球面, 因此具有更多結合DNA的位點.他們利用五代樹枝狀分子氨基修飾的DENPs(樹枝狀分子)與金納米粒子結合能夠顯著提高樹枝狀聚合物致密壓縮DNA的能力. Au-DENPs被用作基因載體在體外對不同細胞系的熒光素酶(Luc)和綠色熒光蛋白(EGFP)均能轉載.

石墨烯復合的超支化基因載體

磁性納米顆粒結合的超支化基因載體

量子點是在納米尺度上的原子和分子的集合體, 既可由一種半導體材料組成, 如由IIB-VIA族元素(如CdS, CdSe, CdTe, ZnSe等)或IIIA-VA族元素(如InP, InAs等)組成, 也可以由兩種或兩種以上的半導體材料組成.作為一種新穎的半導體納米材料, 量子點具有許多*的納米性質. Endres等報道了兩親性生物可降解嵌段共聚物PEG-PCL-PEI自組裝生成的含一個外圍親水性聚乙二醇(PEG)和內核疏水性聚己內酯(PCL)的納米載體.并且通過調控三個單體的比例可以控制納米載體的物化性質. PEG由于其較好的親水性降低了生物毒性, 而支化的PEI在親水疏水核的周圍可以很好地復合核酸.疏水性內核可以攜帶疏水性藥物以及熒光染料或量子點.量子點的核殼結構(如CdSe/ZnS)可以包覆進聚合物組裝的納米載體疏水層中, 而且親水層的外延可以將量子點保持在水溶液中.量子點較寬的激發波范圍可用于體內體外環境的成像.三聚復合物PEG-PCL-PEI是集治療成像于一體的多功能納米基因載體.

無機材料具有很多優異的特性(比如熱輻射性, 磁性等), 特別是無機納米顆粒, 往往具有宏觀所沒有物理化學性能.納米材料指的是納米結構按一定方式堆積或一定基體中分散形成的宏觀材料.無機納米結構為至少一維尺寸在1～100 nm區域的結構, 它包括納米粒子、納米纖維、納米薄膜、納米塊狀和納米晶等.樹枝狀分子樹枝狀聚合物與不同無機物的結合, 賦予樹枝狀基因載體新的生命力.

金納米顆粒結合的樹枝基因載體

4 功能響應性的樹枝狀聚合物載體

綜上所述, 基于樹枝狀聚合物及其衍生物在體內體外多種細胞組織實現了基因轉載, 可以實現靶向性以及多功能抗癌治療.基于樹枝狀聚合物基因載體由于樹枝高分子/超支化分子具有無基因尺寸限制、可大量生產且產品質量重復性好、價格低、使用簡單方便、易于修飾、靈活多變等優點而受到研究者的廣泛關注.樹枝聚合物基因載體為未來非病毒載體的發展開拓了新的領域.

除了上述的pH響應型基因載體, 利用二硫鍵響應的氧化還原型基因載體報道也很多. Ping等制備了一系列含有二硫鍵的生物可降解的超支化聚酰胺-胺, 該高分子以三級胺為核心, 同時利用聚乙二醇、N-氨乙基piperazine(AEPZ)進行末端修飾(圖 18).該分子中具有的還原響應性的二硫鍵在細胞質中被還原物質迅速降解, 能實現DNA的智能釋放, 使得該類雙重響應性聚酰胺-胺的轉染效率遠高于非響應性的聚酰胺-胺.原子力顯微鏡(AFM)圖顯示這種高分子能夠與DNA復合從而得到穩定的、帶正電荷的粒徑為50～200 nm的納米顆粒.實驗表明PAA末端基團結構顯著影響基因體外活轉染, 而末端叔胺修飾的PAA可以安全進行基因傳遞. Russ等利用疊氮基修飾的聚天冬氨酸-琥珀亞胺為主鏈物質, 通過Click反應與炔基修飾的雙硫鍵PEI分子偶聯得到了聚天冬氨酸基礎上的刷狀聚乙烯亞胺衍生物.體外實驗顯示該聚合物可以壓縮DNA, 被細胞內吞后, 二硫鍵在細胞內打開, 迅速釋放包覆的DNA.

雖然傳統型的樹枝狀聚合物基因載體應用廣泛, 不同類別的樹枝分子各有所長, 并在不同腫瘤細胞中發揮基因治療作用, 特別是氨基酸及多肽的修飾, 實現了在特定細胞或體內組織的轉染靶向性.但是他們本身的生物毒性和細胞相容性限制了其發展, 所以需要對樹枝高分子進行化學修飾以彌補其本身的不足.通過對樹枝高分子的修飾, 可以增加細胞的攝取率, 提高其在生物體內轉染基因的效率, 拓展了樹枝高分子在基因治療中的應用范圍.超分子母體材料的修飾提高了樹枝聚合物的細胞膜穿透力, 并且可以構建不同拓撲結構的智能基因載體; 并且超分子母體材料疏水性的內腔可以包結脂溶性藥物, 實現多功能基因治療.但是超分子母體材料本身需要進行單取代、多取代等官能團修飾后才能與樹枝高分子結合.而且除了天然的環糊精外, 其他的超分子母體材料都是需要繁雜的有機合成步驟合成進行, 使其應用受限.無機物的修飾賦予樹枝狀聚合物新的性質, 使得多功能型基因載體應運而生.然而無機物本身容易在體內產生抗原抗體反應, 必須經過修飾處理形成水溶性/生物相容性等才能在體內進行安全基因治療.而功能響應型的樹枝狀聚合物基因載體, 如pH響應、二硫鍵響應可以提高血清抵抗性及細胞相容性.氟功能化樹枝分子提高了細胞攝取率以及內涵體的脫離.但是目前關于功能響應的樹枝基因載體在體內體外的轉染的臨床治療工作還是比較缺乏.總之, 樹枝狀聚合物通過物理或化學方法將多種有機無機材料結合在一起進行多功能療法, 該療法中采用了抗癌藥物、靶向配體、顯像劑等相結合的方式.這將打開安全有效多功能抗腫瘤靶向基因治療的大門.

6總結和展望

Huang等利用谷氨酸和賴氨酸不同的pKa值, 設計合成了pH響應型的聚多肽分子.由于帶正電荷的納米載體在血液中具有很強的非特征性的細胞攝取能力, 并且與血清發生強烈的相互作用, 導致其在體內的嚴重沉聚而很快被循環清除, 從而限制了其應用(圖 17).基于以上原因, 他們設計合成了聚谷氨酸-共-賴氨酸的共聚體, 將其與順鉑絡合形成新的腫瘤細胞外pH值觸發的電荷逆轉順鉑聚(谷氨酸-共-賴氨酸).由于共聚物等電點的影響, 其在血液中(pH=7.4)帶負電而具有較長的半衰期, 而在達到癌癥區域(pH=6.8)后會轉變成帶正電荷的大分子, 因而可以提高腫瘤細胞的攝取率. pH響應型的超支化分子不僅利于基因的運載, 也利于疏水性藥物在體內的釋放與吸收. Lakkakula等利用pH引發縮醛乙酰化α-CD納米粒子與紫杉醇自組裝形成基因載體.在較低的pH值下復合體分解, 釋放出紫杉醇.體外和體內研究研究證明紫杉醇的運載和基因轉載能力均有較率.

樹枝化聚合物除了在結構式修飾、嵌合得到優良性質的樹枝狀基因載體以外, 還在功能響應基因載體方面有著突破性進展.由于人體內復雜的細胞內外液環境以及各類生物活性酶的存在, 在體內實現基因轉載有很多障礙.因此能實現pH或者其他功能響應型的樹枝狀聚合物基因載體在臨床有更廣闊的應用.

氟修飾的樹枝基因載體

含氟化合物被廣泛地應用在材料、催化以及生物醫學領域中.由氟修飾的樹枝狀高分子具有疏水又疏脂的特殊性質.氟取代的樹枝高分子由于其易于合成、的轉染效率和低的細胞毒性為傳統樹枝狀聚合物基因載體開辟了新的研究領域.研究表明氟功能化樹枝分子可顯著提高細胞攝取率以及內涵體的脫離. Liu等利用五氟丁酸酐、七氟丁酸酐和九氟丁基磺酸酐為氟源將五代PAMAM進行氟代化(圖 19).作者進一步利用YOYO-1 (Y3601)標記的DNA[同時利用Lyso-Tracker Red(溶酶體紅色熒光探針)標記的內涵體]在HeLa細胞中進行細胞轉染, 共聚焦顯微鏡(白色箭頭)顯示YOYO-1標記的DNA在細胞內涵體中出現.實驗表明氟代化的PAMAM樹枝高分子作為基因載體在人體腎臟上皮細胞(HEK293細胞)和宮頸癌細胞(HeLa細胞)中的應用均取得很好轉載效率(90%).氟代化的樹枝狀高分子可以極大地提高基因載體的細胞轉染效率并降低細胞毒性.后期研究結果表明氟代化的三、四、五代聚(丙烯亞胺)(PPI)在體外細胞轉染中也表現出很好的效率.

非病毒載體包括陽離子脂質體、樹枝狀聚合物和多肽都為基因載體提供了新途徑.不少病毒載體的基因治療實現了從實驗室進入臨床試驗過程, 已經批準的基因治療臨床試驗方案有數千項, 其中大部分都是針對惡性腫瘤的治療, 但是安全轉載效率高的非病毒載體的需求仍然迫切.而樹枝狀聚合物基因載體臨床治療工作還是比較少.樹枝聚合物的引入可以很好地構建多種構型的基因載體, 為載體的功能化和靶向型提供更多的選擇性.隨著對樹枝狀聚合物分子的深入研究, 樹枝狀聚合物分子在基因轉載上的運用會越來越廣泛.以樹枝狀聚合物為基礎的樹枝狀聚合物基因藥物輸送和基因運載作為臨床上可行的抗癌療法將會得到越來越多科學家的親睞.