染料法嗜血支原體通用實時定量PCR試劑盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Universal Hemoplasma

貨號：Mqs-hae-20        規格：20個反應

貨號：Mqs-hae-50        規格：50個反應

貨號：Mqs-hae-100         規格：100個反應

  儲存：-20度，避光保存，保質期一年。避免反復凍融。

試劑盒特點：

1，可作為嗜血支原體通用試劑盒使用，可檢測絕大部分目前已知的嗜血支原體。

2，使用熱啟動的Taq酶，可抑制非特異性擴增，降低背景熒光。

3，帶有陽性對照樣品，可用于檢驗試劑盒有效性，以及驗證待測樣品中是否含有PCR抑制劑。

4，帶有ROX參比染料，幫助校正加樣誤差和管間差異。

5，帶有UDG酶和dUTP，可降低殘留DNA的污染。

6，本試劑盒靈敏度高，可檢出反應液中最少達1-10個基因組。

嗜血支原體（Hemotropic mycoplasmas，或hemoplasmas）寄生于多種哺乳動物血液中，附著于紅細胞表面，無細胞壁，具多形性，可通過血液傳播。嗜血支原體曾被命名為血巴爾通體/血巴通氏體（Haemobartonella）和 附紅細胞體（Eperythrozoon），分類為立克次氏體屬，現已重新歸類為支原體屬。臨床上嗜血支原體可引發溶血性貧血癥，其他癥狀還包括：厭食癥、昏睡癥、脫水、體重減輕、突然死亡等，有時表現為急性發作，也有很多動物感染后癥狀輕微或無癥狀。不同種動物感染的嗜血支原體有遺傳相似性，提示有跨物種傳播的可能性。目前已在貓、狗、豬、牛、羊、駝、鼠等動物中發現嗜血支原體，很多動物的血液支原體感染仍為未知狀態。

嗜血支原體尚不能體外培養，一般采用PCR法在血液或組織樣本中檢測。常規PCR方法較為繁瑣，耗時較長，較易產生非特異性擴增；探針法實時定量PCR具有更強的特異性，較少受到殘留DNA的污染，較難識別未知物種；SYBR法實時定量PCR可兼具二者的優點，通過熔解曲線來區分不同的PCR產物，提高檢測的特異性，相較探針法，又可在一定程度上識別未知物種。

染料法嗜血支原體通用實時定量PCR試劑盒采用SYBR染料法，根據嗜血支原體的16S rRNA基因序列，設計通用引物，可識別寄生于常見哺乳動物（如：貓、犬、豬、牛、羊、鼠等）的所有已知嗜血支原體。通過BLAST驗證，本試劑盒與非嗜血支原體的其他物種無交叉反應，個別物種可能產生的非特異信號可通過Tm值輕易排除。使用本試劑盒對320個貓血樣進行檢測，獲得139個陽性。對擴增產物進行測序，證實為嗜血支原體特異性擴增，其中包括貓的全部三種嗜血支原體。

本試劑盒可識別的嗜血支原體包括：Mycoplasma haemofelis、Candidatus Mycoplasma haemominutum、Candidatus Mycoplasma turicensis、Mycoplasma haemocanis、Candidatus Mycoplasma haematoparvum、Mycoplasma suis、Mycoplasma wenyonii、Candidatus Mycoplasma haemobos、Mycoplasma ovis、Mycoplasma haemomuris、Mycoplasma coccoides、Candidatus Mycoplasma haemolamae、Mycoplasma erythrodidelphis、Candidatus Mycoplasma kahanei等。

下表列出已知的可識別嗜血支原體種類：

本試劑盒包含熱啟動Taq酶、dNTP（以UTP代替了TTP）、引物、陽性對照品、SYBR Green I染料、ROX染料，和用以防止殘余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用戶只需準備好DNA樣品即可使用。

本產品僅供研究使用。

相關小知識：

熱啟動Taq酶結合了特異性單克隆抗體的DNA聚合酶，在室溫下聚合酶活性被抗體抑制。在PCR循環的變性階段，抗體受熱被去除，聚合酶活性恢復，因此獲得“熱啟動"功能，可減少殘余DNA的污染，提高PCR擴增效率、靈敏度和目的片段產量。

SYBR Green I可以與DNA雙鏈的小溝結合，結合后在497nm激發光照射下產生520nm的發射光。未結合雙鏈DNA的SYBR Green I基本不產生熒光。因此可以根據熒光值的大小判斷溶液內DNA雙鏈的多寡，用于實時檢測PCR反應過程中產物的累積量。初始模板濃度越高，反應循環數越高，則雙鏈DNA含量越高，熒光值也就越高。值得注意的是，SYBR Green I也可以結合非特異性PCR產物以及引物二聚體，此時產生的熒光與目標擴增產物無法區分。為了判斷熒光信號是否來自目標擴增產物，可以繪制熔解曲線。通過逐步緩慢升溫，使雙鏈DNA解離為單鏈DNA，同時檢測熒光值的變化，繪制曲線，根據熒光值觀察DNA解鏈的溫度。

UDG和dUTP可以阻止前次步驟殘余DNA的擴增。dUTP可以確保擴增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可從單鏈或雙鏈DNA上去除尿嘧啶殘基，從而阻止含有尿嘧啶的DNA作為下幾輪PCR的模板。在PCR循環開始前的UDG孵育步驟，可以破壞帶有尿嘧啶的PCR產物。經過該去除污染步驟后，UDG在正常的PCR循環過程中被高溫滅活，對PCR反應沒有影響。

ROX不參與PCR反應，在PCR反應過程中熒光沒有變化，可以提供一條基線用于校正加樣誤差和管間差異，便于儀器自動分析報告熒光與內參ROX熒光的比值，使定量更準確。ROX染料的激發波長為584nm，發射波長為612nm。用ROX進行校正后可以使實驗誤差減小十倍左右。

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