青光眼通常分為幾種類型，其中原發(fā)性開角型青光眼（POAG）是最常見的一種。盡管對青光眼發(fā)病機(jī)制知之甚少，但由于小梁網(wǎng)（TM）處的細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致對房水流出的抵抗增加，可能導(dǎo)致眼內(nèi)壓（IOP）升高，這被認(rèn)為是POAG的主要危險(xiǎn)因素之一。TM位于前房角的角鞏膜緣區(qū)，是一種機(jī)械敏感組織，是房水流出眼球外的主要通道。盡管潛在的機(jī)制仍然難以捉摸，但據(jù)報(bào)道，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路參與調(diào)節(jié)TM中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生。研究表明，ERK通路可以影響人眼小梁細(xì)胞（TMCs）中MMPs的分泌，這可能導(dǎo)致ECM的異常積累，從而導(dǎo)致眼壓升高，最終發(fā)展為青光眼。

由IOP驅(qū)動的房水的大量流動對常規(guī)的流出通道施加了剪切應(yīng)力。預(yù)計(jì)該剪切應(yīng)力在2-25 dyn/cm2 的范圍內(nèi)，由于青光眼患者的眼壓升高，該值可能更高。現(xiàn)有研究表明，TMC可以響應(yīng)房水流施加的剪切應(yīng)力，從而提供了一種調(diào)節(jié)反饋手段來控制眼壓。

患POAG的風(fēng)險(xiǎn)明顯隨著年齡的增長而增加。TMCs的衰老被認(rèn)為是POAG發(fā)生或進(jìn)展的主要危險(xiǎn)因素。大量研究表明，細(xì)胞衰老可以改變 TMCs 的形態(tài)、細(xì)胞骨架、表型和功能的。然而，細(xì)胞衰老如何影響TMCs對剪切應(yīng)力的反應(yīng)卻鮮為人知。

在這里，生物力學(xué)與力生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國家納米科學(xué)中心、中國科學(xué)院力學(xué)研究所的一項(xiàng)聯(lián)合研究探討了衰老對豬眼小梁（PTM）細(xì)胞對剪切應(yīng)力反應(yīng)的影響，研究結(jié)果表明，細(xì)胞衰老損害了PTM細(xì)胞對剪切應(yīng)力的生理反應(yīng)。

高氧誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型

在這項(xiàng)研究中，研究人員采用了高壓氧治療來誘導(dǎo)衰老細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常PTM形態(tài) 相比（圖1 A），這些細(xì)胞在40% O2中的生長表現(xiàn)出擴(kuò)大的細(xì)胞形態(tài)（圖1 B）。暴露于高氧 2 周后，PTM 細(xì)胞的細(xì)胞衰老標(biāo)志物 β-半乳糖苷酶呈陽性（圖1 D），而對照PTM細(xì)胞的染色可以忽略不計(jì)（圖1 C），如圖1 E所示。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比（圖1 G），暴露于高氧后，G2/M 期細(xì)胞的比例似乎在減少（圖1H）。定量結(jié)果顯示在圖1 F。

圖1   高氧作為豬小梁網(wǎng)（PTM）細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/span>

在對照（A）或高氧（40% O2）條件（B）下PTM細(xì)胞生長2周的形態(tài)。在對照（C）或高氧（40% O2）條件（D）下生長2周的PTM細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色。在對照條件下生長的PTM細(xì)胞對衰老標(biāo)志物β-半乳糖苷酶的染色可以忽略不計(jì)，而暴露于高氧的細(xì)胞對該標(biāo)志物染色呈陽性（E）。與對照組相比，高氧暴露后S期和G2期的細(xì)胞比例下降（F）。流式細(xì)胞術(shù)定量PTM細(xì)胞在對照（G）或高氧（40% O2）條件（H）下生長2周的細(xì)胞周期。

衰老對PTM細(xì)胞細(xì)胞骨架和細(xì)胞剛度響應(yīng)剪切應(yīng)力的影響

PTM細(xì)胞的量化排列被描述為相對于流軸 ±30° 范圍內(nèi)的細(xì)胞比例。對于正常的PTM細(xì)胞，如圖2 A、B，暴露于25 dyn/cm2的剪切應(yīng)力12小時后，與靜態(tài)組相比（無剪切應(yīng)力），與流向軸（0°）方向角在 -30°至30° 之間的細(xì)胞比例明顯增加。相比之下，對于衰老的PTM細(xì)胞，與靜態(tài)組相比，暴露于剪切應(yīng)力后，細(xì)胞的百分比沒有顯著變化（圖2 A、B）。這些結(jié)果表明，在暴露于25 dyn/cm2的剪切應(yīng)力12小時內(nèi)，正常的PTM細(xì)胞傾向于向流動方向定向運(yùn)動，而衰老的PTM細(xì)胞則沒有以相同的方式響應(yīng)。

如圖2 C，與正常PTM細(xì)胞相比，這些衰老PTM細(xì)胞的F-肌動蛋白含量顯著增加。當(dāng)細(xì)胞暴露于剪切應(yīng)力時，正常和衰老PTM細(xì)胞中的F-肌動蛋白含量均顯著提高。相應(yīng)地，原子力顯微鏡（AFM）結(jié)果表明，PTM細(xì)胞的衰老導(dǎo)致細(xì)胞剛度增加（圖2 D）。在受到剪切應(yīng)力后，正常和衰老的PTM細(xì)胞都表現(xiàn)出增加的細(xì)胞剛度。實(shí)驗(yàn)定量地觀察到，正常和衰老PTM細(xì)胞在暴露于剪切應(yīng)力后，剛度分別增加了67.44% 和 36.14%。正如預(yù)期的那樣，同時將 PTM 細(xì)胞暴露于高氧和剪切應(yīng)力下，與對照組相比，細(xì)胞剛度發(fā)生了zuixian'zhu的變化（圖2 D）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞剛度與F-肌動蛋白含量呈正相關(guān)。

圖2   衰老對PTM細(xì)胞細(xì)胞骨架和細(xì)胞剛度響應(yīng)剪切應(yīng)力的影響。

（A）在靜態(tài)條件（無剪切應(yīng)力）或承受 25 dyn/cm2 剪切應(yīng)力下正常和衰老 PTM 細(xì)胞的熒光圖像。（B）正常和衰老PTM細(xì)胞在靜態(tài)條件下或承受剪切應(yīng)力的細(xì)胞骨架排列。（C）正常和衰老PTM細(xì)胞在靜態(tài)條件下或承受剪切應(yīng)力的F-肌動蛋白含量。（D）正常和衰老PTM細(xì)胞在靜態(tài)條件下或承受剪切應(yīng)力的細(xì)胞剛度。

衰老對PTM細(xì)胞響應(yīng)剪切應(yīng)力下的細(xì)胞遷移的影響

進(jìn)行Transwell測定以確定承受剪切應(yīng)力的正常和衰老PTM細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常PTM細(xì)胞相比，衰老PTM細(xì)胞的遷移速率顯著降低。在剪切應(yīng)力下暴露12 h后，正常PTM細(xì)胞的遷移能力比靜態(tài)組顯著提高。然而，對于衰老的PTM細(xì)胞則相反。

衰老對PTM細(xì)胞響應(yīng)剪切應(yīng)力下的MMP、金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）和膠原mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果表明，與靜態(tài)組相比，正常的PTM細(xì)胞暴露于剪切應(yīng)力12 h后，MMP-1，MMP-2，TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。然而在衰老的PTM細(xì)胞中，除TIMP-1外，這些特定蛋白的mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)。此外，在暴露于剪切應(yīng)力后，正常和衰老PTM細(xì)胞中I型膠原（COLA-1）和IV型膠原（COLA-4）的mRNA表達(dá)均未發(fā)生變化。

衰老對PTM細(xì)胞響應(yīng)剪切應(yīng)力下ERK蛋白表達(dá)的影響

最后，實(shí)驗(yàn)還使用蛋白質(zhì)印跡分析研究了ERK的表達(dá)和磷酸化。對于正常的PTM細(xì)胞，與靜態(tài)組相比，暴露于剪切應(yīng)力12小時后p-ERK /總ERK比值顯著增加。相比之下，觀察到暴露于剪切應(yīng)力12小時后衰老PTM細(xì)胞的p-ERK /總ERK比率顯著降低（圖3 A、B）。為了進(jìn)一步研究衰老對ERK表達(dá)和磷酸化的影響，實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用短期剪切應(yīng)力，研究了正常和衰老PTM細(xì)胞的剪切應(yīng)力暴露時間依賴性。如圖3 C、D，對于正常的PTM細(xì)胞，與靜態(tài)組相比，暴露于剪切應(yīng)力10分鐘和30分鐘后，p-ERK /總ERK比值大致保持不變。然而，對于衰老的PTM細(xì)胞，p-ERK/總ERK比值顯著下降到剪應(yīng)力暴露后12 h的值，甚至是10分鐘（圖3 C、D）。這些結(jié)果表明，在正常或衰老的PTM細(xì)胞中，ERK磷酸化響應(yīng)剪切應(yīng)力的改變發(fā)生在不同的時間點(diǎn)。

圖3    衰老對PTM細(xì)胞響應(yīng)剪切應(yīng)力下的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和p-ERK表達(dá)的影響。

（A、B）在靜態(tài)條件下或承受12小時剪切應(yīng)力下正常和衰老PTM細(xì)胞的p-ERK和ERK表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。（C、D）在靜態(tài)條件下或經(jīng)受 10 分鐘和 30 分鐘剪切應(yīng)力下正常和衰老 PTM 細(xì)胞的 p-ERK/總ERK 蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。

綜上所述，pTMCs可以通過改變生物力學(xué)特性和生理功能來感知和響應(yīng)剪切應(yīng)力。然而，細(xì)胞衰老改變了機(jī)械生物學(xué)反應(yīng)，并且在大多數(shù)情況下，使細(xì)胞對剪切應(yīng)力的反應(yīng)降低，這可能導(dǎo)致細(xì)胞TM功能隨著年齡的增長而逐漸衰竭。盡管TMCs的機(jī)械生物學(xué)很重要，但我們對TMCs在青光眼或衰老中的機(jī)械應(yīng)力反應(yīng)行為的了解非常有限。這項(xiàng)研究為衰老通過影響TMC功能障礙在調(diào)節(jié)眼壓中的作用提供了新的線索，這將加深對POAG病理生理學(xué)的理解。

參考文獻(xiàn)：Du R, Li D, Zhu M, Zheng L, Ren K, Han D, Li L, Ji J, Fan Y. Cell senescence alters responses of porcine trabecular meshwork cells to shear stress. Front Cell Dev Biol. 2022 Nov 21;10:1083130. doi: 10.3389/fcell.2022.1083130. PMID: 36478743; PMCID: PMC9721263.

小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請聯(lián)系小編修正。

微信搜索公眾號“Naturethink"，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。