醫(yī)學和社會都迫切需要改進重大皮膚受損或缺陷的治療方法。自 1982 年以來，通過持續(xù)的機械拉伸（3-5個月）誘導皮膚再生，皮膚組織擴張已被證明是一種有效和必要的皮膚缺損治療方法。機械拉伸及其如何誘導細胞增殖一直是一個熱門話題。信號換能器，如MAPK、整合素、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2 和蛋白激酶 B 被發(fā)現(xiàn)在角質(zhì)形成細胞中被短期（不超過7天）機械刺激激活。研究表明，主要的轉(zhuǎn)錄因子YAP被證明可以在各種細胞中轉(zhuǎn)導機械信號，是控制表皮增殖的關鍵調(diào)節(jié)因子。然而，關于長期（LT）機械拉伸對濾泡間表皮干細胞（IFESC）激活和增殖的影響知之甚少。但上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科的一項研究發(fā)現(xiàn)，皮膚再生與機械拉伸持續(xù)時間之間存在一種意想不到的相關性。

機械拉伸對IFESCs增殖的調(diào)控具有時間依賴性

實驗首先研究機械拉伸（0.5HZ，10%伸長率）對皮膚再生的影響。結果發(fā)現(xiàn)，短期（1個月）機械拉伸促進了表皮增殖，拉伸的表皮基底細胞中增殖細胞核抗原和p63（表皮增殖細胞標志物）、角蛋白（K）5、K14和K15（表皮基底細胞標志物）的免疫染色增加（圖1 a、b）。然而，LT拉伸（5個月）導致增殖細胞核抗原、K5、K14和p63 的免疫染色降低（圖1 a、b）。這項臨床研究的結果表明，機械拉伸誘導的皮膚再生具有時間相關性。

接下來，研究人員在體外IFESCs中建立了一個LT拉伸模型。結果發(fā)現(xiàn)，在72小時內(nèi)，機械拉伸比未拉伸對照組引起的增殖率更高，這與之前的報告一致。然而，IFESCs的細胞增殖和集落形成能力在7周后顯著降低（圖1 c、d），K5和ΔNP63的表達也降低（圖1 e-g）。以上結果清楚地證明了機械拉伸持續(xù)時間對皮膚再生的兩種不同影響，即短期與LT效應。

研究推測，LT機械拉伸誘導的皮膚細胞生長停滯可能歸因于機械拉伸誘導的表觀遺傳修飾。為了測試這一點，需要鑒定IFESCs中機械轉(zhuǎn)導的靶基因。YAP被證明可以在表皮中轉(zhuǎn)導機械信號，不同的刺激對生長的調(diào)控也是通過不同的YAP靶基因?qū)崿F(xiàn)的，即使在單細胞類型中。因此，首先確定了YAP在機械轉(zhuǎn)導中的靶基因。結果表明，只有KLHL21敲低顯著抑制了由機械力學而不是其他基因誘導的IFESCs的增殖，而且KLHL21與IFESCs增殖呈正相關。YAP或KLHL21的抑制都可以顯著抑制IFESCs在體內(nèi)的增殖。此外，還分析了YAP和KLHL21在體外LT機械拉伸過程中的蛋白表達。結果發(fā)現(xiàn)，YAP和KLHL21在拉伸1周后增加，但在7周拉伸后恢復到與基礎水平相似的水平。這些結果表明，短期機械拉伸能夠觸發(fā)YAP的激活和核積累，誘導KLHL21的表達，從而促進IFESCs的增殖。

圖1   機械拉伸對IFESCs增殖的時間依賴性調(diào)控。

LT機械拉伸增加H3K27me3修飾

接下來，實驗檢測了YAP靶基因的表觀遺傳狀態(tài)。有趣的是，在LT拉伸組中，在靶基因之一EGR3的基因體中，兩個位點被鑒定為高甲基化。在排除DNA甲基化后，研究了組蛋白H3K27的三甲基化狀態(tài)（組蛋白H3K27位點的三甲基化被認為是轉(zhuǎn)錄抑制的標志）。在體外發(fā)現(xiàn)，LT拉伸顯著提高了KLHL21啟動子中的H3K27me3水平（圖2 c）。在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，拉伸5個月的表皮基底細胞中KLHL21啟動子中的H3K27me3顯著升高（圖2 d）。因此，測試了已知控制H3K9或H3K27甲基化的各種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達。在檢查的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶中，H3K27me3表觀遺傳調(diào)控因子PRC2的催化亞基EZH2在LT拉伸的IFESCs中增加。與用于H3K4或H3K30的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶相比，在IFESCs中，只有EZH2被LT拉伸上調(diào)（圖2 e、f）。這些結果表明，LT機械拉伸增加了EZH2的表達，從而誘導了表觀遺傳修飾（H3K27me3）。而這是否是LT機械拉伸導致IFESCs生長停滯的原因，還有待研究。

圖2   LT機械拉伸誘導H3K27me3修飾。

EZH2過表達抑制IFESC增殖

為了測試上述疑問，實驗在IFESCs中過度表達了EZH2。EZH2過表達導致EZH2和H3K27me3表達增加，KLHL21表達降低（圖3 a、b）。實驗還通過抑制集落形成能力（圖3 c）和細胞增殖（圖3 d）觀察到了同樣預期結果。此外，在EZH2過表達的細胞中，短期拉伸誘導的YAP核易位也減少（圖3 e、f）。熒光素酶報告基因測定表明，當EZH2過表達時，組成型活化的YAPS127A 與 KLHL21啟動子區(qū)域的結合被阻斷（圖3 g）。這些結果證實了，EZH2的過表達抑制了IFESC的增殖。

圖3   EZH2過表達在體外抑制IFESC增殖。

抑制EZH2挽救LT機械拉伸誘導的生長停滯

EZH2的藥理學抑制劑—GSK343，用于測試抑制EZH2是否能挽救LT機械拉伸誘導的IFESC生長停滯。體外實驗表明，GSK343對YAP、KLHL21和EZH2的蛋白表達沒有影響（圖4 a）。LT機械拉伸降低了YAP的核易位，并且在GSK343干預后明顯阻斷了這種效應（圖4 b、c）。此外，GSK343（1μM，7周）降低了H3K27me3水平（圖4 d），并挽救了LT拉伸后IFESCs中降低的KLHL21表達（圖4 e）和集落形成能力（圖4 f）。在體內(nèi)，GSK343皮內(nèi)注射（10μM，4周）導致表皮厚度增加（圖4 g），K14和ΔNP63表達增加，并減少每毫米表皮毛囊數(shù)量（圖4 h）。免疫熒光染色顯示，GSK343誘導了更多的K5- 和P63- 陽性基底細胞，表皮厚度增加（圖4 i）。這些體外和體內(nèi)研究表明，EZH2抑制劑可以抑制H3K27me3的形成，挽救IFESCs的增殖停滯。這些闡明了LT機械拉伸可以增加EZH2表達，從而誘導表觀遺傳修飾（H3K27me3），這就是LT機械拉伸導致IFESC生長停滯的原因（圖4 j）。

圖4   抑制EZH2可挽救LT機械拉伸誘導的生長停滯。

綜上所述，這項研究表明，干細胞增殖與EZH2調(diào)控的機械拉伸持續(xù)時間之間存在意想不到的相關性。這項誘導細胞生長停滯的長期機械拉伸的研究為臨床轉(zhuǎn)化促進皮膚再生提供了一種策略。

參考文獻：Wang J, Zhang Y, Gao Y, Shan S, Li Q. EZH2 Regulates the Correlation between Skin Regeneration and the Duration of Mechanical Stretch. J Invest Dermatol. 2021 Apr;141(4):894-902.e9. doi: 10.1016/j.jid.2020.09.007. Epub 2020 Oct 16. PMID: 33069730.

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