正畸牙齒移動作為一種矯正錯位牙齒的治療手段，如果不使牙周組織的結構成分（包括牙齦、牙周韌帶 （PDL）、牙骨質和牙槽骨）暴露在各種類型的壓力下，就無法誘導。由于其作為牙齒和骨骼之間連接的核心元素的位置和功能，PDL，特別是其主要的細胞類型，PDL成纖維細胞，在適應壓力方面起著關鍵作用。

正畸牙齒移動是通過對牙周膜施加機械應力引起的，這導致細胞和組織的局部生物力學應變，隨后是無菌炎癥，涉及炎性細胞因子的釋放，主要是白細胞介素-1（IL-1β）。少量 IL-1β已被證明有益于牙周重塑，包括傷口愈合，而 IL-1β 過量生成已被證明在牙周疾病病因中起作用。

研究表明，自噬是PDL成纖維細胞壓力調節的關鍵過程。此外，炎癥細胞因子IL-1β 也以劑量依賴性方式調節自噬相關基因，表明自噬在牙周炎癥中起重要作用。自噬受到多種信號通路的調節。其中最關鍵的是哺乳動物雷帕霉素（mTOR）信號通路靶點，該信號通路抑制自噬。上游的磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt（PI3K/AKT）是mTOR的重要調節通路。在下游，mTOR與真核細胞翻譯啟始因子4E結合蛋白1（4E-BP1）和70-kDa核糖體蛋白S6激酶（P70S6K）相互作用，促進蛋白質合成。

因此，德國波恩大學正畸系、雷根斯堡大學醫學中心正畸科、美因茨大學約翰內斯·古騰堡大學醫學中心的一項聯合研究探討了不同程度的機械壓力和炎癥刺激是如何影響PDL成纖維細胞的自噬活性的，此外還分析mTOR通路是否受到不同程度的壓力或炎癥刺激的影響。

機械壓力和炎癥刺激對自噬的影響

首先，在機械和炎癥刺激 PDL成纖維細胞4、16或24小時后，分析測量自噬體的積累（圖1 a-c）。

結果表明，機械壓力為 4、6 和 8 g/cm2持續4小時導致熒光強度顯著增加近2倍，而2 g/cm2的壓力沒有顯著改變熒光強度。壓力加載16小時后，與對照細胞相比，所有測試壓力水平均顯著增加熒光強度。8 g/cm2組的熒光強度增加了3倍以上。然而，24小時后，施加8 g/cm2的最大壓力不再增強熒光強度；2、4和6 g/cm2的較低壓力量級仍顯示熒光強度顯著增加（圖1 b）。

有趣的是，用 0.1 ng/mL IL-1β進行炎癥刺激4 h可使熒光強度顯著降低 25% 以上，而濃度為1 ng/mL則沒有任何顯著影響。然而，濃度為10 ng/mL IL-1β的濃度在同一時間范圍內使熒光強度增加了25%以上。當PDL成纖維細胞在炎癥條件下培養16和24小時時，所有評估的IL-1β濃度均顯著提高熒光強度（圖1 c）。

圖1(a） 對于 FACS 分析，定義并設置了決定性細胞群，如左圖所示。在y軸上，顯示了最大熒光事件的百分比（右圖）。（b）熒光顯示，在2、4、6或8 g/cm2或無壓力處理4、16或24 h后，自噬體積累的影響。自噬通量通過氯喹處理中斷。（c）用0.1、1.0或10 ng/mL IL-1β處理4、16或24小時或不處理后，熒光顯示對自噬體積累的影響。自噬通量通過氯喹處理中斷。

機械壓力和炎癥刺激對mTOR信號通路的影響

總體而言，由于機械壓力或炎癥刺激，磷酸化蛋白的比例比非磷酸化蛋白的比例更大。2 g/cm2 的壓力刺激（代表正畸牙齒移動期間的生理條件）比應激條件下（即超負荷和炎癥）引起的比率變化要小。

AKT磷酸化的平衡在生理負荷條件下轉向降低磷酸化。壓力過載增加了磷酸化位點Ser124上的AKT1磷酸化比例，但對磷酸化位點Tyr474上的AKT1磷酸化有不利影響。炎癥使磷酸化位點 AB-124 和 AB-450 上的 AKT1 磷酸化比例升高。然而，與對照組相比，磷酸化和非磷酸化蛋白AKT的倍數變化顯示出總體下調。與對照組相比，mTOR蛋白的變化也低于0.75倍。

上游，非磷酸化和磷酸化的PI3K的平衡在壓力過載或炎癥刺激后轉向磷酸化。在下游，在不同的結合位點評估多種蛋白質，如4E-BP1和P70S6K。壓力為 2 g/cm2 導致磷酸化位點Thr45上的4E-BP1磷酸化水平降低，而IL-1β增加了4E-BP1的比例。磷酸化位點Ser418上的P70S6K磷酸化的倍數變化在所有治療組中均增加了1.6倍以上。

機械壓力和炎癥刺激對膠原蛋白1 基因表達的調控

mTOR的激活控制蛋白質合成。因此，在刺激24小時后評估膠原蛋白1的基因表達，膠原蛋白1是PDL成纖維細胞產生的細胞外基質的最重要成分。雷帕霉素處理后抑制mTOR顯著降低膠原1基因表達。此外，各種程度的機械壓力顯著降低了膠原蛋白1的基因表達，在4 和 6 g/cm2 的壓力組中，降低了 75% 以上。中等濃度 IL-1β 的炎癥刺激也導致膠原蛋白1的基因表達降低 50% 以上。然而，低濃度和高濃度的 IL-1β 處理對膠原1基因表達沒有顯著影響（圖2 a）。

圖2（a）2、4、6、8 g/cm2的壓力或0.1、1.0、10 ng/mL 濃度的IL-1β對24 h后I型膠原蛋白基因表達的影響。未處理的細胞作為對照。雷帕霉素處理抑制mTORC1作為陰性對照。（b）2、4、6、8 g/cm2的壓力或0.1、1.0、10 ng/mL 濃度的IL-1β對24 h后對Ki67基因表達的影響。未處理的細胞作為對照。雷帕霉素處理抑制mTORC1作為陰性對照。

機械壓力和炎癥刺激對增殖標記物Ki67基因表達的影響

細胞命運通路mTOR調節細胞增殖。因此，在機械壓力和炎癥刺激后，分析了細胞增殖特異性標志物 Ki67的基因表達。雷帕霉素對mTORC1的抑制導致Ki67基因表達減少。生理壓力為 2 g/cm2對Ki67基因表達有不良影響，并誘導Ki67表達上調近 50%。更高的壓力幅度為 4 和 6 g/cm2時下調Ki67的基因表達。有趣的是，壓力為 8 g/cm2 對2Ki67基因表達無顯著影響（圖2 b）。低濃度IL-1β處理沒有改變 Ki67 基因表達，而較高濃度的1和10 ng/mL IL-1β處理使Ki67基因表達顯著降低了40% 以上（圖2 b）。

機械壓力和炎癥刺激對細胞死亡的影響

細胞死亡由mTOR通路決定，與自噬密切相關。通過FACS分析鑒定碘化丙啶（PI）陽性細胞。

有趣的是，應用2 g/cm2 的壓力持續24小時可顯著降低20% 以上的細胞死亡，因此其具有細胞保護作用。16小時后，相同的壓力顯著增加PI陽性細胞。用 2g/cm2壓力處理24小時，與對照組相比，并沒有顯著改變PI陽性細胞的數量。加壓4小時后，僅8 g/cm2的高幅度壓力能顯著誘導細胞死亡 20% 以上，而4和6 g/cm2的壓力對死亡細胞數量無顯著影響。然而，在用4、6和8 g/cm2的壓力持續16和24小時后，死亡細胞數量顯著增加2倍以上（圖3 a）。

炎癥刺激4小時沒有改變細胞死亡率。與對照相比，在炎癥條件下培養16小時導致死亡細胞數量增加 25% 以上。有趣的是，24小時后，低濃度和高濃度IL-1β提高了細胞死亡數，而與對照組相比，中等濃度的IL-1β減少了死亡細胞的數量（圖3 b）。

圖3   （a）用2，4，6或8 g/cm2的壓力持續4，16或24小時或無壓力無氯喹處理后，熒光顯示對細胞死亡的影響。（b）用0.1、1.0或10 ng/mL IL-1β處理4、16或24小時或無氯喹處理后，熒光表示對細胞死亡的影響。

綜上所述，該研究結果為PDL成纖維細胞在機械壓力和炎癥刺激后的自噬活動提供了新的見解。應激刺激的自噬反應是劑量和時間依賴性的。一般來說，自噬是由應激刺激誘導的，而短暫應用低壓或低IL-1β濃度不會影響或減少自噬。此外，mTOR通路還受到生理壓力、過載和炎癥刺激的影響。研究結果還表明，mTOR信號通路對機械壓力和炎癥應激后自噬活性的影響。通過蛋白質合成、增殖和細胞死亡分析，機械壓力和炎癥刺激的影響也可以通過細胞命運的變化檢測到。細胞死亡受到機械壓力和炎癥刺激的調節。有趣的是，生理壓力為 2 g/cm2 時甚至可以發揮保護作用，而過載會增加死亡細胞的數量。關于炎癥刺激誘導細胞死亡，治療持續時間似乎比IL-1β濃度更重要。

參考文獻：Blawat K, Mayr A, Hardt M, Kirschneck C, Nokhbehsaim M, Behl C, Deschner J, J?ger A, Memmert S. Regulation of Autophagic Signaling by Mechanical Loading and Inflammation in Human PDL Fibroblasts. Int J Mol Sci. 2020 Dec 11;21(24):9446. doi: 10.3390/ijms21249446. PMID: 33322510; PMCID: PMC7763506.

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