骨缺損指骨的結構完整性被破壞，是臨床常見病。基于干細胞的骨組織工程技術是再生骨缺損的一種有前途的策略。骨組織工程的基本概念是通過結合生長因子、合適的支架和特定的成骨細胞或其祖細胞來產生新的骨。然而，骨組織是由幾種細胞類型及其周圍的細胞外基質形成的復雜結構。因此，了解每種細胞類型之間的關系以達到成功的骨再生非常重要。由于這些原因，研究人員已轉向共培養研究以增強骨骼再生。

間充質干細胞（MSCs）是組織工程中細胞治療的重要來源。間充質干細胞通過細胞與細胞間的直接接觸誘導直接效應，并分泌趨化因子和細胞因子用于旁分泌和自分泌功能，在組織再生中產生營養支持。內皮祖細胞（EPCs）具有分化為成熟內皮細胞的能力，并且EPCs在血管生成中的作用已在體外和體內得到廣泛研究。EPCs能夠促進宿主骨缺損的再生，這可能是血管形成增加和參與骨愈合的其他細胞/分子因素的結果。EPCs與MSCs的結合對細胞增殖和分化有深遠的影響。研究表明，EPCs和MSCs的共同培養可顯著改善骨形成，但MSCs和EPCs在成骨中的關系尚未闡明。

因此，中國醫科大學附屬第四醫院口腔科、中國醫科大學口腔醫學院的一項研究在共培養實驗中使用MSCs和EPCs研究它們的成骨相互作用，鑒定驅動這種相互作用的基因表達變化，確定EPCs如何影響MSCs的成骨分化，并研究了絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路在成骨分化中的參與。

首先，內皮祖細胞和骨髓間充質干細胞經分離鑒定后，設立兩種細胞共培養的實驗組和骨髓間充質干細胞單獨培養的對照組。然后鑒定了成骨誘導過程中EPCs-MSCs 共培養與MSCs單培養組的差異調控基因。差異表達基因的KEGG富集分析表明，許多信號通路，包括MAPK，ECM-受體相互作用，TNF，PI3K-Akt和HIF-1，都受到共培養的EPCs的調控。在這些通路中，MAPK主要受到與EPCs共培養的影響。

接下來，為了研究EPCs對MSCs分化的影響，在成骨誘導培養基中培養MSCs。結果表明，當與EPCs共培養時，MSCs在分化方面表現不同。當MSCs 與EPCs共培養時，觀察到ALP（堿性磷酸酶）增加。實驗在第1天、第7天和第14天測量ALP活性，數據顯示，當MSCs與EPCs共培養時，ALP活性增加，與第1天和第7天相比，第14天時ALP活性最高，EPCs在7 和14 天顯著提高了MSCs的ALP活性，分別提高了14.91% 和30.52%（圖1 a）。

在第14天進行qRT-PCR定量成骨基因表達，包括Runx2、OPN和BSP，以研究EPCs對MSCs分化的影響。結果表明，與單層間充質干細胞相比，EPCs在共培養的MSCs中顯著提高了42.16% 的OPN mRNA表達，BSP和Runx2 mRNA水平在共培養的MSCs中也分別顯著提高了29.87% 和34.52%（圖1 b）。

這些數據表明，EPCs增加間接共培養的MSCs的成骨基因表達。

圖1   EPCs促進MSCs的成骨分化。

（a）在誘導成骨分化后第7、14和21天通過ALP染色確定成骨分化。（b）在成骨分化誘導后第14天通過qRT-PCR測量成骨基因OPN，BSP和Runx2的表達。（c）EPCs促進MSCs的MAPK信號通路的激活，通過蛋白質印跡檢查p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK表達。（d）通過免疫印跡法測定p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK的蛋白質水平，β-肌動蛋白作為內對照。

此外，qRT-PCR和蛋白質印跡法用于評估MAPK通路是否參與成骨。與單獨培養的MSCs相比，與 EPCs共培養的MSCs中的p38磷酸化水平顯著上調。然而，JNK和ERK1/2磷酸化水平沒有顯著改變（圖1 c、d）。qRT-PCR數據顯示，在MSCs-EPCs共培養組中，p38基因表達顯著上調75.27%。在MSCs-EPCs共培養組中，TAB1和MKK6基因表達也顯著上調116.93% 和112.51%（圖1 e）。這些數據表明，EPCs 促進 TAB1、MKK6 和 p38 基因表達以及 p38 磷酸化。

為了進一步研究EPCs是否通過MAPK信號通路促進MSCs的成骨分化，實驗使用了p38信號抑制劑SB 203580，ERK信號抑制劑FR180204和 JNK 抑制劑 SP600125 來評估共培養的 MSCs 中 MAPK 信號通路和成骨分化的變化。用特異性通路抑制劑處理后，測定p38、ERK1/2、JNK的蛋白質及其磷酸化蛋白水平和MSCs的成骨能力。結果表明，通過SB203580、FR180204和 SP600125處理，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平顯著降低（圖2 a、b）。ALP實驗和茜素紅染色進一步證實了MAPK信號通路對MSCs成骨分化能力的調控。結果表明，SB203580顯著降低了ALP水平和鈣結節形成（圖2 c-f）。這些數據表明，EPCs通過促進p38 MAPK信號通路激活來參與MSCs 的成骨分化。

圖2   EPCs通過促進MAPK磷酸化誘導成骨分化。

（a）MSCs 用p38通路抑制劑SB203580、ERK通路抑制劑FR 180204或JNK通路抑制劑SP600125預處理，然后與EPCs共培養，并通過免疫印跡檢查p38、p-p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK和JNK的蛋白質水平。（b）通過免疫印跡法檢測p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK和JNK的相對蛋白水平，β-肌動蛋白作為內對照。（c）通過ALP染色確定成骨分化。（d）鈣結節的形成通過茜素紅染色測定。（e）相對ALP活性。（f）相對礦化水平。

實驗證明了p38信號通路在共培養的MSCs中起著重要作用。在此觀察之后，實驗最后使用p38 siRNA沉默進一步探索了p38MAPK在促進MSCs成骨分化中的功能。p38 siRNA用于阻止p38MAPK通路激活。結果觀察到p38 siRNA添加到細胞后，p38磷酸化水平顯著降低。然而，p-JNK和p-ERK1/2表達水平沒有顯著改變（圖3 a、b）。接下來，研究了p38 siRNA對MSCs成骨分化的影響。數據顯示，p38沉默顯著降低了Runx2、OPN、BSP和Col I蛋白表達水平（圖3 c、d）。一致地，ALP水平和鈣結節形成均受到p38沉默的抑制（圖3 e-h）。因此，EPCs通過激活p38 MAPK信號通路對MSCs的成骨分化具有積極影響。

圖3   p38 MAPK信號通路參與MSCs成骨分化。

（a）用siRNA-p38轉染MSCs，并通過免疫印跡檢查p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK和JNK的蛋白表達，β-肌動蛋白作為內對照。（b）p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK 和 JNK 相對蛋白質水平的密度測定法。（c）免疫印跡法檢測OPN、BSP、Runx2 和 Col I 的蛋白表達。（d）OPN、BSP、Runx2和Col I相對蛋白質水平的密度測定。（e）通過ALP染色確定成骨分化。（f）相對ALP活性。（g）通過茜素紅染色形成鈣結節。（h）相對礦化水平。

總之，這項研究的結果支持EPCs可以在體外增強MSCs成骨分化的觀點。EPCs對 MSCs的分化和成骨具有深遠的影響，EPCs顯著促進了MSCs 的成骨基因表達和蛋白質合成。ALP活性和鈣結節形成也顯著增加。EPCs的外泌體或旁分泌因子影響MSCs的生物學功能，激活p38MAPK通路可能是增強MSCs成骨分化的關鍵。對細胞相互作用的進一步了解對于理解體外細胞動力學將是無價的，最終有助于更合理的組織工程策略。

參考文獻：Xu C, Liu H, He Y, Li Y, He X. Endothelial progenitor cells promote osteogenic differentiation in co-cultured with mesenchymal stem cells via the MAPK-dependent pathway. Stem Cell Res Ther. 2020 Dec 11;11(1):537. doi: 10.1186/s13287-020-02056-0. PMID: 33308309; PMCID: PMC7731475.

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