機械力學信號對骨量調節、骨穩態和骨骼適應有深遠影響。通常，機械力傳遞到骨組織，并由機械敏感細胞（骨細胞、成骨細胞、破骨細胞及其祖細胞）感知，通過細胞增殖、分化和凋亡導致成骨。許多體外研究證實，成骨細胞對各種不同的剪切應力（FSS）都有敏感反應，其中常用的范圍為0.5-2Pa。迄今為止，FSS對骨重塑的影響已受到廣泛關注，但對其潛在的分子機制知之甚少，例如FSS如何與其他過程（包括自噬）整合，從而極大地促進骨重塑以刺激成骨細胞的分化。

膜聯蛋白A（AnxA）是一個鈣離子依賴的磷脂結合蛋白家族，參與細胞膜的組成、胞吞、胞吐、離子通道調節、離子通道活性、細胞信號轉導及細胞膜與細胞骨架的連接等。研究表明，成骨細胞和平滑肌細胞中AnxA6的異常表達會導致一些病理過程，例如骨質疏松癥和動脈粥樣硬化。此外，AnxA6通過調節囊泡脂膜的形成和促進細胞胞吐作用來促進自噬過程。膜聯蛋白在細胞中的表達和分布對機械微環境的變化高度敏感，尤其是流體流動，而AnxA6在FSS介導的成骨細胞礦化中的作用尚不清楚。

鑒于自噬在成骨細胞增殖和分化中的作用，以及AnxA6參與自噬過程，在四川華西基礎醫學與法醫學院生物醫學工程研究室的一項研究中，闡明了AnxA6調節的自噬在FSS介導的成骨細胞分化中的作用。

FSS誘導成骨細胞分化

為了研究FSS對骨形成的影響，首先探討了FSS如何影響機械力學敏感細胞MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨細胞前體細胞系）的成骨分化。不同強度的FSS，分別為0（靜態對照）、5、10和20dyn/cm2，應用于MC3T3-E1細胞1h。結果顯示，與對照組相比，FSS顯著促進成骨標志物ColI和ALP的表達（圖1A、B）。隨著FSS強度的增加，ColI表達上調，在20dyn/cm2組中觀察到最高表達，而ALP的表達在10dyn/cm2的條件下最高。

為了優化FSS對成骨細胞分化的影響，在FSS強度為10dyn/cm2的情況下，對MC3T3-E1細胞施加0（靜態對照）、0.5、1、2、4h不同的加載時間。結果顯示，10dyn/cm2FSS的強度引起成骨分化相關基因Runx2、ALP和ColI的表達，在1h后增加到較高水平（圖1C、D）。此外，分別對MC3T3-E1細胞進行ALP染色和ALP活性監測，以進一步探討FSS對成骨分化的影響。如圖1E、F，與靜態組相比，暴露于10dyn/cm21h時ALP陽性細胞增加了1.8倍。ALP活性也表現出3.6倍的顯著增強（圖1G）。

這些結果表明，10dyn/cm2強度的FSS持續1h有利于MC3T3-E1細胞的成骨分化。

圖1 FSS誘導成骨細胞分化。

FSS促進MC3T3-E1細胞中AnxA6的表達

為了研究AnxA6對FSS的響應，對MC3T3-E1細胞施加0，5，10和20dyn/cm2的FSS1h。通過蛋白質印跡測定，AnxA6在5和10dyn/cm2下表達顯著升高，但暴露于20dyn/cm2時明顯下降（圖2A、B）。

為進一步探討FSS加載持續時間對AnxA6表達的影響，在強度為10dyn/cm2下的MC3T3-E1細胞上應用0、0.5、1、2和4h的不同加載時間的FSS。與靜態組相比，FSS處理1h后AnxA6升高至圖示較高水平，而在處理0.5和4h后，AnxA6表達下降（圖2C、D）。MC3T3-E1細胞用10dyn/cm2的FSS處理1h后，AnxA6的免疫熒光強度升高（圖2E）。

這些結果表明，10dyn/cm2強度的FSS持續1h可以促進AnxA6的表達，這與圖1中Runx2、ALP和ColI的表達一致，表明AnxA6表達與成骨分化之間存在潛在相關性。

圖2 FSS促進MC3T3-E1細胞中AnxA6的表達和易位。

AnxA6參與FSS誘導的成骨分化

通過構建穩定的AnxA6敲低的MC3T3-E1細胞系，研究AnxA6對成骨細胞分化的影響。在MC3T3-E1細胞中，AnxA6的缺乏導致礦物沉積減少，ALP陽性細胞減少，ALP活性降低。成骨相關蛋白ALP和ColI表達的降低進一步證實了AnxA6缺失對成骨分化的抑制。為了進一步探索AnxA6在FSS調節的成骨中的作用，對shCtrl和shAnxA6MC3T3-E1細胞施加1h10dyn/cm2的FSS，結果表明，當暴露于10dyn/cm2的FSS1h時，shAnxA6細胞中ALP和ColI的表達恢復到較高水平，但在相同的FSS負荷下，仍然不能超過shCtrl細胞中的水平。

敲低AnxA6在FSS條件下損害自噬

接下來探討了FSS誘導的AnxA6是否會影響自噬。與靜態組相比，暴露于5、10和20dyn/cm2的細胞自噬標志物Beclin1、ATG5和ATG7表達較高，并伴有較多的LC3B-I轉化產生大量的LC3B-II，表明自噬流發生加速。

通過調節FSS持續時間進一步研究了FSS加載時間對自噬的影響。與靜態對照相比，10dyn/cm2FSS持續0.5和1h后MC3T3-E1中Beclin1、ATG5和ATG7的表達增加，而自溶酶體中可被降解破壞的p62顯著降低。這些結果表明，10dyn/cm2強度的FSS持續1h可導致自噬的顯著發生。

為了揭示AnxA6在FSS誘導的自噬中的作用，應用1h10dyn/cm2的FSS到shCtrl和shAnxA6MC3T3-E1細胞。實驗發現，無論FSS負荷如何，在shCtrl組中，Beclin1和ATG5在FSS中顯著增加，而其在AnxA6敲低細胞中受到極大抑制（圖3A、B）。透射電子顯微鏡（TEM）的結果與上述蛋白質印跡分析呈現相似的趨勢（圖3C）在shCtrl細胞中通過FSS誘導形成更多的自噬體，而AnxA6敲低細胞顯示出自噬體的數量減少。此外，暴露于FSS時細胞質中有更多的LC3B點狀分布，表明自噬流的發生，盡管敲低AnxA6組阻礙了該過程（圖3D）。

這些結果表明，FSS可以通過誘導AnxA6誘導自噬的發生。

圖3 敲低AnxA6會損害FSS誘導的自噬。

FSS通過激活AnxA6介導的自噬來促進成骨分化

為了進一步剖析自噬在成骨分化和基質礦化中的作用，實驗在體外礦化過程中使用自噬抑制劑（氯喹）和自噬激活劑（雷帕霉素）調控自噬狀態。用成骨培養基培養MC3T3-E1細胞7或14天后，氯喹對自噬的抑制大大減少了ALP陽性染色細胞的數量，并抑制了礦化結節的形成，而雷帕霉素激活自噬顯示出截然相反的效果，促進了礦化過程（圖4A、B）。此外，氯喹的添加降低了MC3T3-E1細胞中Beclin1和ATG7的表達，以及ALP和ColI的表達。另一方面，雷帕霉素上調自噬和成骨細胞分化相關蛋白表達（圖4C、D）。這些結果表明，自噬調節引起了成骨細胞分化和礦化的改變。

最后實驗研究了FSS誘導的AnxA6是否通過激活自噬來增強成骨細胞分化。由于敲低AnxA6在靜態和FSS條件下均導致自噬和成骨分化的抑制，因此雷帕霉素用于恢復AnxA6敲低抑制的自噬流，并隨后檢測成骨標志物的表達，以確定自噬在此過程中的影響。如圖4E、F，雷帕霉素的前提條件恢復了在shAnxA6組中受到抑制的ALP和ColI的表達，特別是在FSS負荷條件下。此外，ALP和ColI的表達與自噬標志物（包括Beclin1、ATG5和ATG7）的表達呈正相關。

總體而言，FSS通過AnxA6介導的自噬激活有助于成骨細胞的分化和礦化。

圖4 FSS通過激活AnxA6介導的自噬來促進成骨分化。

圖5 FSS通過膜聯蛋白A6介導的自噬促進成骨細胞分化。

MC3T3-E1細胞對外部機械力學刺激敏感。一旦FSS施加在MC3T3-E1細胞上，AnxA6就可以直接或與其他機械傳感器協同響應FSS，伴隨著其從細胞質到細胞膜的易位。隨后，AnxA6表達升高影響下游自噬流，并進一步調節成骨分化。

綜上所述，該研究結果表明，AnxA6調節的自噬在FSS誘導的成骨分化中起重要作用。實驗發現1h10dyn/cm2的FSS可提供足量的AnxA6來啟動自噬并增加ALP和ColI表達，導致成骨分化。AnxA6的敲低強烈抑制自噬，從而降低了成骨分化，而自噬激活劑恢復的自噬流也可恢復FSS對成骨分化的影響。所有這些結果為FSS誘導的成骨機制提供了新的見解。

參考文獻：

Pei T, Su G, Yang J, Gao W, Yang X, Zhang Y, Ren J, Shen Y, Liu X. Fluid Shear Stress Regulates Osteogenic Differentiation via AnnexinA6-Mediated Autophagy in MC3T3-E1 Cells. Int J Mol Sci. 2022 Dec 11;23(24):15702. doi: 10.3390/ijms232415702. PMID: 36555344; PMCID: PMC9779398.

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