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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 貨號 | 12302ES05 |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 生物產業 |
產品介紹
Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 儲存 | 價格（元） |
Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix | 12302ES05 | 500 T | -20℃ | 1526.00 |
Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard 1-6 | 12307ES09 | 6×96 μL | -20℃ | 2126.00 |
產品描述
本產品是用于lllumina®平臺高通量測序文庫濃度定量的試劑盒，提供定量所需的DNA標準品、qPCR Master Mix、定量擴增引物和參比染料ROX。其中，DNA標準品包含經梯度稀釋的六份450 bp的雙鏈DNA///片段溶液，濃度為20 pM-0.0002 pM；擴增引物對根據NGS文庫接頭序列P5和P7設計，可保證特異性擴增雙端接頭完整的文庫分子；qPCR Master Mix是基于抗體法熱啟動的染料法qPCR預混液，可在不同長度、不同GC或AT含量樣本中高效、特異擴增，實現精確定量。
本試劑盒已經過嚴格的質量和功能檢測，試劑盒所有組分均達到DNA污染控制的嚴格質控要求，應用于NGS文庫定量精確靈敏，且批間穩定，結果重現性優異。
產品組分
組分編號 | 組分名稱 | 規格 | 12302ES05 | 12307ES09 |
12302-A | Hieff NGS® SYBR qPCR Master Mix (2×) | 5×1 mL | √ | -- |
12302-B | qPCR Primer Mix | 600 μL | √ | -- |
12302-C | 50×Low Rox | 200 μL | √ | -- |
12302-D | 50×High Rox | 200 μL | √ | -- |
- | DNA Standards 1-6 | 6×96 μL | -- | √ |
注意：
1. 根據儀器類型選擇合適的參比染料ROX。
類別 | 機型 |
不添加ROX | Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; Cepheid SmartCycler®; Eppendorf Mastercycler®ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene®Q, Rotor-Gene®3000, Rotor-Gene®6000; Roche Applied Science LightCyclerTM480; Thermo Scientific PikoReal Cycler. |
添加50×High Rox | Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne™, StepOnePlus™. |
添加50×Low Rox | Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA™7; Stratagene MX4000™, MX3005P™, MX3000P™ |
2. qPCR Primer Mix 中包含一對引物，序列如下，可預先通過引物序列確認文庫是否可以被該引物對擴增。
Primer 1：5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3'
Primer 2：5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3'
運輸與保存方法
冰袋運輸。所有組分應-20℃保存，qPCR Master Mix與ROX避光保存，有效期6個月；如短期內反復使用，qPCR Master Mix可解凍后于4℃避光暫存，有效期3個月。
注意事項
一、關于操作
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 請于使用前確保產品凍融和*混勻，短暫離心收集至管底后置于冰上備用。
3. 為保證產品品質，避免反復凍融超過30次！
4. 為避免樣品交叉和氣溶膠污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。
5. 試劑吸取時應保證槍頭適當深入液體，排出時應確認槍頭無殘留。
二、關于文庫稀釋
文庫需稀釋至標準曲線有效Ct范圍內進行定量，稀釋比例可參照過往經驗或使用其他測定方式測定的濃度作為參考（如NanoDrop®，Qubit®或Bioanalyzer）。使用本試劑盒可定量的文庫濃度范圍參見下表。
由于DNA在非緩沖環境中易降解，因此應使用緩沖稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）稀釋文庫，切勿使用水作為稀釋液。測定時，文庫應現測定現稀釋，置于冰上待測，切勿使用以往配制的儲存的稀釋后文庫。
表1 DNA Standard濃度
DNA Standard | 摩爾濃度 | 質量濃度 | 拷貝數濃度 |
Std 1 | 20 pM | 5.5 pg/μL | 12×106 copies/μL |
Std 2 | 2 pM | 0.55 pg/μL | 12×105 copies/μL |
Std 3 | 0.2 pM | 0.055 pg/μL | 12×104 copies/μL |
Std 4 | 0.02 pM | 0.0055 pg/μL | 12×103 copies/μL |
Std 5 | 0.002 pM | 0.00055 pg/μL | 12×102 copies/μL |
Std 6 | 0.0002 pM | 0.000055 pg/μL | 12×101 copies/μL |
三、污染與陰性對照（Contamination and No-template Controls）
1. 進行qPCR實驗時，應保證良好的實驗操作規范，以防對工作區域、試劑、耗材、儀器、DNA標準品等造成污染。推薦將反應體系配制區和模板制備區進行物理隔離，并定時使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑對各實驗區域進行擦拭清理。
2. 反應體系配制過程中DNA Standards的加入應按照從低濃度至高濃度（DNA Standard 6至1）的順序進行，每次移液都應更換新的槍頭，以避免氣溶膠污染。
3. 每次實驗都應平行進行NTC陰性對照反應，配合融解曲線進行擴增特異性和體系污染程度分析。因擴增引物序列為Illumina®平臺固定序列而非qPCR引物序列，且擴增循環數較多，NTC陰性對照反應出現引物二聚體擴增進而產生Ct屬正常情況。正常情況下Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3。
四. 擴增曲線基線設置
因DNA Standard 1的摩爾濃度遠遠高于常規qPCR模板，其Ct往往非常小。而大部分qPCR儀器都默認將3-15循環設置為基線（Baseline），有時會將DNA Standard 1的Ct值誤認為是測定時的噪聲背景，繼而影響標準曲線制作。手動設置基線（Baseline）為1-3循環可以有效避免這種情況發生。
五、文庫長度矯正
為避免片段長度對文庫定量的影響，需要在定量結果計算時，對文庫長度進行矯正。根據文庫熒光染料SYBR® Green I結合DNA后產生的熒光強度與DNA分子量成正比的原則，根據以下公式進行文庫濃度長度矯正。
矯正后的稀釋文庫濃度（pM）= [450 bp /文庫平均長度（bp）] × 稀釋文庫的濃度（pM）
六、融解曲線分析
融解曲線在配合NTC陰性對照進行污染程度分析以及確認標準曲線大有效Ct時至關重要，推薦每次實驗都進行融解曲線采集步驟。本產品，DNA Standards產生的熔解曲線呈現特征單峰。
圖1 文庫標準品熔解曲線
使用方法
一、解凍試劑
將Hieff NGS® qPCR Mix，Primer Mix，DNA Standards 1-6，文庫稀釋液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20），ROX Dye（如需要）從冰箱中拿出，冰浴解凍。各試劑解凍后，渦旋混勻，短暫離心后置于冰上備用。
二、稀釋文庫
使用文庫稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）對待測文庫進行適當稀釋。推薦稀釋度為1:1000-1:100000。對于高濃度文庫，可額外設置3個2倍稀釋梯度，如按1:1000稀釋文庫，可額外設置1:2000，1:4000，1:8000稀釋比例，以保證測定值在試劑盒所提供的標曲范圍內。
三、反應體系配制
于反應管中配制如下體系，上下顛倒或渦旋振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。
表2 qPCR反應體系
名稱 | 體積 |
Hieff NGS® SYBR qPCR Master Mix（2×） | 10 μL |
qPCR Primer Mix | 1 μL |
Diluted DNA Library/DNA Standard 1-6/ddH2O* | 2 μL |
ddH2O | 7 μL |
Total | 20 μL |
注：1）每個反應至少設置3個平行；2）推薦進行20 μL反應體系，如需進行10 μL反應，則將體系各組分等比減少；3）*在陰性對照反應管中加入ddH2O；在樣品反應管中加入稀釋后的文庫；在標準曲線反應管中加入DNA Standards；4）根據機型添加合適ROX，推薦加入量0.4 μL。
四、qPCR運行程序
將反應管置于qPCR儀中，按下述條件設置qPCR反應程序，并運行（熔解曲線可根據儀器默認即可）。
表3 qPCR程序
步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
預變性 | 95℃ | 5 min | 1 cycle |
循環反應 | 95℃ | 10 sec | 40 cycles |
60℃ | 45 sec* | ||
熔解曲線 | 95℃ | 15 sec | 1 cycle |
60℃ | 60 sec | ||
95℃ | 15 sec |
注：*當文庫平均長度>700 bp時，建議延伸時間延長至90 sec。
五、數據分析
1. 標準曲線制作
1）根據復孔間Ct差異≤0.2的原則，對DNA Standards原始Ct進行過濾，并計算平均Ct。
2）使用有效范圍內的Ct（作為縱坐標）和Log[pM]（作為橫坐標）繪制標準曲線。參照NTC陰性對照Ct確認標準曲線Ct有效范圍。
如Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3，則大有效Ct為Ct (DNA Standard 6)，應使用DNA Standard 1-6所產生的Ct繪制標準曲線；
如Ct (DNA Standard 6) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 5) + 3，則大有效Ct為Ct (DNA Standard 5)，應使用DNA Standard 1-5所產生的Ct繪制標準曲線；
如Ct (DNA Standard 5) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 4) + 3，則大有效Ct為Ct (DNA Standard 4)，應使用DNA Standard 1-4所產生的Ct繪制標準曲線；
基于定量準確性考慮，請至少使用4個Ct (DNA Standards)繪制標準曲線。如Ct (DNA Standard 4) + 3 > Ct (NTC)，提示定量體系存在嚴重污染，需更換體系中所有組分后重復試驗。
3）繪制的標準曲線相關系數R2應不低于0.99，斜率應位于-3.1至-3.6之間（表示擴增效率位于90%-110%之間）。如標準曲線參數不佳，應重復試驗。
2. 文庫濃度計算
稀釋文庫的Ct只有位于標準曲線有效Ct范圍之內才可用于濃度計算，同時應對文庫進行長度矯正。可根據下述公式計算原始文庫濃度（nM）：
原始文庫濃度（nM）= [450 bp /文庫平均長度（bp）] × 稀釋文庫的濃度（pM）× 稀釋倍數/1000
六、使用案例
用Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®定量嗜鹽桿菌基因組DNA文庫，文庫GC含量為70%，長度450 bp。將文庫稀釋10000倍上機檢測，結果如下圖所示。根據標曲及公式，文庫終濃度=4.37 pM × 稀釋倍數10000=43.7 nM。
圖2 文庫qPCR精確定量
常見問題
問題 | 可能原因與解決方法 |
擴增效率不在90%-110% | 1. 如Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) < 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1，且計算擴增效率超過100%，提示反應體系有污染。應根據NTC陰性對照的融解曲線確認污染源（文庫污染或DNA Standards污染）。 2. 不恰當的基線基線（Baseline）設置。手動調整基線（Baseline）為1-3循環。 3. 移液精確度差，重復實驗，確保所有試劑使用前*溶解并混勻。 |
相關系數R2 < 0.99 | 1. 移液精確度差，重復實驗，確保所有試劑使用前*溶解并混勻。 2. 儀器相關問題，確保儀器與ROX匹配使用。 |
標曲擴增曲線分布不均一 | 1. Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1，提示反應體系有污染。根據NTC 陰性對照的融解曲線確認污染源（文庫污染或DNA Standards污染）。 2. Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) < 3.1，提示基線基線（Baseline）設置不當。手動調整基線基線（Baseline）為1-3。 3. DNA Standards之間的ΔCt > 3.6，提示擴增效率差。確認所有試劑在使用前都已充分解凍并*混勻；確認所有組分濃度正確以及反應程序無誤。 4. 長時間強光照射會導致qPCR Master Mix熒光值下降，進而造成ΔCt > 3.6。應按照推薦方式避光貯存試劑。 |
復孔重復性差 | 1. 移液精確度差，重復實驗，確保所有試劑使用前*溶解并混勻。 2. 儀器相關問題，確保儀器與ROX匹配使用。 |
文庫稀釋液ΔCt不在合理范圍（如2倍稀釋文庫，ΔCt為0.9-1.1） | 1. 移液精確度差，重復實驗，確保所有試劑使用前*溶解并混勻。 2. 文庫難于擴增。GC/AT含量過高或長度超過1 kb的文庫擴增效率較差。 3. 文庫降解。文庫應現用現稀釋，稀釋好的文庫應置于冰上備用。 |
文庫各稀釋度計算的初始文庫濃度差異超過10% | 1. 移液精確度差，重復實驗，確保所有試劑使用前*溶解并混勻。 2. 文庫難于擴增。GC/AT含量過高或長度超過1 kb的文庫擴增效率較差。 3. 文庫降解。文庫應現用現稀釋，稀釋好的文庫應置于冰上備用。 |
稀釋文庫Ct值不在標曲Ct的有效范圍 | 1. 使用有效范圍內的Ct值計算文庫濃度。當Ct (稀釋文庫) < Ct (DNA Standard 1)，提示文庫稀釋度不夠，應提高文庫稀釋倍數重復實驗。 2. Ct (稀釋文庫) > Ct (DNA Standard 6)，提示文庫稀釋度過高，應減少稀釋倍數重復實驗。 3. 推薦稀釋度為1:1000-1:100000。對于高濃度文庫，可額外設置3個2倍稀釋梯度，如按1:1000稀釋文庫，可額外設置1:2000，1:4000，1:8000稀釋比例，以保證測定值在試劑盒所提供的標曲范圍內。 |
DNA Standard 1擴增曲線異常 | 不恰當的基線基線（Baseline）設置。手動調整基線（Baseline）為1-3循環。 |
DNA Standards有擴增，而文庫沒有或Ct很大 | 1. 文庫接頭序列錯誤。核對文庫末端序列與試劑盒提供的引物序列是否匹配。 2. 稀釋度過高。減少稀釋倍數，重復實驗。 3. 文庫降解。文庫應現用現稀釋。 |
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