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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

本試劑盒是利用拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase）高效快速連接DNA段的原理進(jìn)一步研發(fā)而成，與傳統(tǒng)的T4連接酶相比，具有以下優(yōu)勢(shì)：1）快速，僅需1-5分鐘即可完成連接反應(yīng)。2）高效，無自連現(xiàn)象，陽性克隆率接近100%，無需設(shè)置藍(lán)白斑篩選；3）操作簡(jiǎn)單，從連接到涂板僅需15-20 min。操作過程省去冰浴、熱激和1 h復(fù)蘇。4）可連接長(zhǎng)達(dá)5 kb目的產(chǎn)物；5）Hieff Clone^TM Topo-blunt simple vector不含多克隆酶切位點(diǎn)（MCS），使用者在引入后續(xù)酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切操作時(shí)，不會(huì)受到MCS位點(diǎn)的影響，從而增加酶切效率以及克隆成功率。

產(chǎn)品用途

平端PCR產(chǎn)物的克隆。

克隆后PCR產(chǎn)物的快速測(cè)序（使用M13F/M13R引物）。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20°C保存，避免反復(fù)凍融。有效期一年。

注意事項(xiàng)

1）pESI-Blunt simple vector (30 ng/ul) 插入位點(diǎn)兩端不含多克隆酶切位點(diǎn)，需要在PCR設(shè)計(jì)引物時(shí)引入合適酶切位點(diǎn)。

2）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、Control DNA 片段的克隆實(shí)驗(yàn)

1）在無菌微量離心管中配制下列DNA溶液，以10 μL為例。

2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5 min。

【注】：連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間不要超過5 min，一般1-2 min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子。

3）連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化或于-20℃保存。

4）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。

【注】：a）也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細(xì)胞中（加入體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)。

b）通常使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細(xì)胞效率較低時(shí)，可以按照冰浴熱激的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。

5）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。

6）取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。

二、 一般DNA段的克隆實(shí)驗(yàn)

所插入片段為平末端產(chǎn)物，利用高保真酶（如Canace高保真酶，Yeasen Cat#10135）擴(kuò)增得到的產(chǎn)物如無非特異性條帶、引物二聚體可直接進(jìn)行連接反應(yīng)。

否則建議膠回收后使用。

【注】：a、PCR產(chǎn)物不能磷酸化。

       b、如擴(kuò)增模板為質(zhì)粒，模板質(zhì)粒會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中引起假陽性，因此推薦PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接。

1）按照下表配制連接體系（以10μL為例）

【注】：a）可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況按照上述比例調(diào)整反應(yīng)體系。

b）不同的插入片段所用量參考下表：

2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5 min。

【注】：連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間不要超過5min，一般1-2min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子。

3）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。

【注】：a）也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細(xì)胞中（加入體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)。

b）通常使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細(xì)胞效率較低時(shí)，可以按照冰浴熱激的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。

4）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。

【注】：通常商品化的感受態(tài)細(xì)胞不超過2 kb插入片段情況下，10 min復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)效率低或者插入片段長(zhǎng)轉(zhuǎn)化子少的情況下可以提高復(fù)蘇時(shí)間到30-60 min以得到更多的轉(zhuǎn)化子。

5） 取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。

6）轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定

a）菌落/菌液PCR鑒定；

b）質(zhì)粒大小鑒定：挑取單克隆，抽提質(zhì)粒后可根據(jù)質(zhì)粒大小進(jìn)行鑒定。

c）酶切鑒定：根據(jù)克隆實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定。
d) 測(cè)序分析：可選測(cè)序引物序列如下：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

  M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

【注】：本制品陽性率相當(dāng)高，一般情況下，陽性克隆率接近100%，只要是長(zhǎng)出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就是陽性克隆，因此插入片段不超過2-3 kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個(gè)菌去測(cè)序。

pESI-Blunt simple vector sequence

ORIGIN

        1 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct

       61 gctgaagcca gttacctcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc

      121 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct

      181 caagaagatc ctttgatttt ctaccgaaga aaggcccacc cgtgaaggtg agccagtgag

      241 ttgattgtgt aaaacgacgg ccagtgtctg aggctcgctt cagtcctgat gcttgttatc

      301 gtattcgcgt gtcgccctta agggcgacac gcgaagtcga tgtcgcgtct gcctgaagtc

      361 aatactgacg atggtcatag ctgtttcctg tccatagcag aaagtcaaaa gcctccgacc

      421 ggaggctttt gacttgatcg gcacgtaaga ggttccaact ttcaccataa tgaaataaga

      481 tcactaccgg gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg

      541 agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt

      601 tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga

      661 gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa

      721 gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt

      781 attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt

      841 gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc

      901 agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga

      961 ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat

     1021 cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct

     1081 gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc

     1141 cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg

     1201 gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc

     1261 ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg

     1321 acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca

     1381 ctgattaagc attggtaatg agggcccaaa tgtaatcacc tggctcacct tcgggtgggc

     1441 ctttctgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat

     1501 cgatgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc

     1561 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc

     1621 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt

     1681 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac

     1741 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg

     1801 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca

     1861 gagtt

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【注】：黃底為多克隆酶切位點(diǎn)序列

相關(guān)產(chǎn)品

HB190514