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細胞增殖-毒性檢測試劑盒 Cell Counting Kit-8(CCK-8)

產品貨號：CK001

儲存條件：CCK-8溶液在避光，0-5℃的條件下可以保存一年； -20℃下保存2年；如需經常使用請將試劑存放在0-5℃，為防止背景值增加干擾實驗結果，請勿反復凍融。

CCK-8試劑使用方法

一、通用操作步驟

1. 在96孔板每孔加入100uL細胞懸液； 2.在培養箱中預培養細胞；3.向培養板中加入藥物(如果不加藥物，直接進行第五步操作)；4.在培養箱中培養一段時間；5. 向每孔加入10 μL的CCK溶液；6. 將培養板在培養箱內孵育1～4小時(根據具體實驗優化)。7. 用酶標儀測定在450nm處的吸光度

二、制作標準曲線（測定細胞具體數量時）

1、先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞。

2、按比例(例如:1/2比例)依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。

3、接種后培養2-4小時使細胞貼壁，然后加CCK試劑培養一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數量為橫坐標(X軸)，OD值為縱坐標 (Y軸)的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量(用此標準曲線的前提條件是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK后的培養時間)

三、細胞活性檢測

1、在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養（在37 °C,5% CO₂的條件下）。

2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。

3、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

5、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

四、細胞增值-毒性檢測

使用方法（以96孔板為例，其他規格培養板按實際情況安排）：

1、在96孔板中配置100μl的細胞懸液（通常細胞增殖實驗每孔加入100μl 2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100μl5000個細胞。具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等因素決定）。按照實驗需要，進行培養（在37 °C，5%CO2,，的條件下）預培養24小時。

2、向培養板加入1-10μl不同濃度的待測藥物刺激。

3、將培養板在培養箱孵育一段適當的時間（后面有具體細胞的建議時間，例如：6、12、24或48小時）。

4、每孔加入10μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。如果起始的培養體積為200μl，則需加入20μl CCK-8溶液，其他情況以此類推。可以用加了相應量細胞培養液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作空白對照。如果擔心所使用的藥物會干擾檢測，需設置加了相應量細胞培養液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。

5、在細胞培養箱內繼續孵育1-4小時，對于大多數情況孵育1小時就可以了。時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時候分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續實驗。

6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。

7、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

8、注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

活力計算： 細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
A（加藥）：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培養基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度
A（0加藥）：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

注意事項：

1、由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養時間較長，一定要注意蒸發的問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養箱內水源的地方，以緩解蒸發。

2、CCK-8檢測細胞活性的原理是通過檢測活細胞脫氫酶催化的反應。任何待測體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設法去除。如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養基，去掉藥物的影響。當然藥物影響比較小的情況可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

3、建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養時間。

4、建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK試劑時，建議斜貼著培養板壁加，不要查到培養基液面下加樣，溶液產生氣泡，會干擾OD值讀數。

5、當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000個/孔（100μl培養基）。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500個/孔，（100μl培養基），且培養時間長一些。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6、加入CCK-8溶液時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色已變化或PH值變化。建議換用新鮮的培養基。

7、如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測靈敏度最高。

8、酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

9、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

CCK-8 試劑參考實驗數據

（此數據僅供參考，建議預先摸索最佳實驗條件）

	細胞種類		接種細胞數量	培養板	培養基名稱	培養基體積	CCK-8試劑量	加入CCK培養時間
1	A549（人肺癌）	貼壁	8000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2-3hr.
2	AGS	貼壁	10000/孔	96	F12	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
3	ASTC-a-1	貼壁	50000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3.5hr.
4	B16（黑色素瘤）	貼壁	4000孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
5	Balb/c 3T3	貼壁	10000孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
6	Bcap-37（人乳腺癌）	貼壁	5000孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
7	Bel-7402 （人肝癌）	貼壁	5000孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
8	CTLL-2	懸浮	10000孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
9	EaHY926	貼壁	20000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
10	ECV340（人臍靜脈血管內皮細胞）	貼壁	20000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
11	HaCaT	貼壁	10000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
12	HAEC	貼壁	10000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
13	HEK-293	貼壁	5000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
14	HepG2（人肝細胞癌）	貼壁	2000/孔	96	DMEM,10%FCS	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
15	Hela（人宮頸癌）	貼壁	2000-25000/孔	96	MEM,10%FCS, L-glutamine	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
16	Ho-8910（人卵巢癌）	貼壁	80000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
17	HL60（人原髓細胞白血病）	懸浮	30000-45000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
18	HLF	貼壁	10000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	1hr.
19	HS 766T（人胰腺癌細胞）	貼壁	100000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
20	Huh7	貼壁	100000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
21	HUVEC	貼壁	5000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
22	Hepatocytes(肝細胞)	貼壁	30000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2-3hr.
23	HSC	懸浮	10000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
24	K562	懸浮	40000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	6hr.
25	L1210（小鼠淋巴白血病）	懸浮	200000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
26	L929(小鼠成纖維細胞株)	貼壁	1000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
27	MCF-7(人乳腺腺癌)	貼壁	10000/孔	96	RPMI1640+10%小牛血清	100ul/孔	10ul/孔	2-3hr.
28	MN9D	貼壁	5000/孔	96	DMEM/F12（1:1）	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
29	NIH3T3	貼壁	10000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	1-2hr.
30	NRK（大鼠腎細胞）	貼壁	5000/孔	96	DMEM+10%小牛血清L- glutamine	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
31	P815	懸浮	10000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
32	PC12	貼壁	10000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3-4hr.
33	（人膽管癌細胞系）QBC939	貼壁	5000/孔	96	RPMI1640+10%TBS	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
34	Raji（人 Burkitt’s 淋巴瘤）	懸浮	100000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	5hr.
35	RAW264.7（小鼠巨噬細胞）	貼壁	20000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
36	SD大鼠脾淋巴細胞	懸浮	3×10⁵-4×10⁵/孔	96	RPMI1640+10%BSA	200ul/孔	10ul/孔	4hr.
37	SGC-996	貼壁	150000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
38	SH-SY5Y	懸浮	12000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
39	SK	貼壁	80000/孔	96	DMEM	500ul/孔	50ul/孔	3hr.
40	SMC	貼壁	20000/孔	96	DMEM	200ul/孔	10ul/孔	4hr.
41	SMMC-7721（人肝癌）	貼壁	1000/孔	96	DMEM,10%FCS	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
42	SPC-A1 （肺腺癌）	貼壁	3000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
43	SW480	貼壁	1000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
44	T-24（人膀胱變異細胞癌）	貼壁	80000/孔	96	DMEM	180ul/孔	10ul/孔	3hr.
45	Tca8113	貼壁	10000000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
46	T淋巴細胞	懸浮	1×10⁴-1×10⁶/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
47	U937	懸浮	200000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
48	Vero E6	貼壁	30000/孔	96	RPMI1640(10%FBS)	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
49	Wish細胞（人羊膜細胞）	貼壁	30000/孔	96	5%BCS MEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
50	7901	貼壁	15000-20000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
51	成纖維細胞	貼壁	1500/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
52	大鼠系膜細胞	貼壁	10000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
53	骨髓間充質干細胞	貼壁	4000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
54	結腸癌Caco-2細胞	貼壁	10000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
55	乳鼠心肌細胞	貼壁	10000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	0.5-3hr.
56	人成骨細胞	貼壁	5000/孔	96	DMEM-LG成骨細胞誘導培養液	100ul/孔	10ul/孔	3hr.
57	人外周血淋巴細胞	懸浮	50000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
58	人支氣管上皮細胞	貼壁	2000/孔	96	LHC-8無血清培養基	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
59	神經母細胞瘤	貼壁	10000/孔	96	MEM	100ul/孔	10ul/孔	2hr.
60	腎小球系膜細胞	貼壁	1000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	1hr.
61	樹突狀細胞	懸浮	1000000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	4.5hr.
62	兔軟骨細胞	貼壁	1000/孔	96	DMEM	100ul/孔	10ul/孔	3-4hr.
63	小鼠脾臟T淋巴細胞	懸浮	2000000/孔	96	RPMI1640	100ul/孔	10ul/孔	4hr.
64	原代大鼠肝臟細胞	貼壁	30000/孔	96	DMEM/F12(1:1)	100ul/孔	10ul/孔	3-4hr.
65	原代胃癌細胞	貼壁	10000/孔	96	RPMI1640人	100ul/孔	10ul/孔	4hr.

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