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本文要點：在近紅外二區（NIR-II，1000-3000 nm）發射的熒光染料為血管和淋巴系統的實時和高分辨率成像提供了重大進展。然而，在體內NIR-II追蹤標記細胞的課題仍然具有挑戰性。在這里，我們開發了一種屏蔽單元-供體-受體-供體-屏蔽單元（S-D-A-D-S）NIR-II熒光團（FE-4ZW），帶有兩性離子末端基團，用于高效細胞標記，而無需使用細胞穿透肽，從而增強了細胞遷移位置的非侵入性體內測定。拴系末端磺基銨內鹽具有對細胞膜的高親和力，因此即使對于固定細胞也能實現穩定的標記。移植干細胞的命運和腫瘤細胞在腦或外周組織中沿淋巴系統的遷移由細胞內化的FE-4ZW清楚地監測。本文還證實，臨床使用的表面活性劑D-α-生育酚聚乙二醇-1000琥珀酸酯可以減少肝臟和脾臟對FE-4ZW的攝取。本文報道的熒光團設計策略和細胞標記技術為細胞遷移的可視化和對重新定位過程的洞察開辟了一個新的領域，從而最終為更詳細地研究干細胞治療和腫瘤轉移的潛在機制提供了機會。
方案1. FE-4ZW作為細胞示蹤劑的制造和體內跟蹤血液循環和淋巴系統中細胞遷移的圖示
本文研究了FE-4ZW和FE-2PEG在單獨靜脈給藥后的體內藥代動力學。與循環時間長且具有部分腎排泄特征的FE-2PEG相比，FE-4ZW在短血循環時間（～50分鐘）內在肝臟和脾臟中積累更快。隨后，肝臟和脾臟中的熒光信號強度隨著時間的推移而增加，逐漸降低（圖1A-C和S13）。基于FE-4ZW與FE-2PEG相比更快的肝臟攝取特征，我們假設當FE-4ZW注射到小鼠的血液循環系統中時，它們也被肝細胞和/或巨噬細胞（Kupffer細胞）內吞。這種發現的差異初步表明，與FE-2PEG相比，FE-4ZW具有更快的積累速率，從而表明FE-4ZW可能與細胞膜具有更強的相互作用，因此有可能作為更好的細胞造影劑。因此，我們設計了廣泛的體外和/或體內實驗來測量FE-4ZW作為細胞造影劑的能力。
圖1. FE熒光團提供有效的第二近紅外（NIR-II）熒光成像對比度水平的能力
由于FE-4ZW與細胞膜之間存在潛在的相互作用和/或親和力，我們的方案不要求使用CPP，因此在獲得熒光細胞方面更加簡化和直接（圖1D-F）。利用幾種類型的細胞系，包括肝臟、巨噬細胞、干細胞和腫瘤細胞來評估 FE 熒光團系列。在FE-4ZW與不同細胞系共孵育的整個過程中，FE-4ZW標記細胞的NIR-II熒光強度隨時間增加，其中在12小時時間點有足夠的標記密度允許明亮的NIR-II成像（圖1F和S5）。對于所有測試的細胞系，FE-4ZW的明亮NIR-II熒光信號允許在內化時明確地勾勒出細胞形狀（圖1E，F和S5）。
圖2. FE-4ZW作為一種高性能細胞標記染料
相比之下，在 L-O2 細胞組中，當它們與 FE-2PEG 或 FE-2PEG2ZW 熒光團一起孵育時，獲得了非常低的熒光強度。這些結果表明，分子結構在作為高效細胞標記生物技術的作用中起著重要作用（圖2A，B）。FE-4ZW的細胞內光穩定性也是通過將標記的L-O2細胞置于連續激光照射下來確定的（圖2C）。熒光信號僅在2小時的時間過程中以極慢的速率衰減。總的來說，FE-4ZW是一種理想的細胞成像劑，具有明亮的細胞內NIR-II熒光發射和優異的光穩定性。FE-4ZW為非侵入性跟蹤體內細胞命運奠定了基礎。
在細胞中使用FE-4ZW孵育12小時后，用新鮮培養基替換含有未內化FE-4ZW的細胞培養基。將標記的細胞順序培養長達 7 天，每天收集上清液并通過 NIR-II 檢測器成像。所有收集的上清液均未觀察到可檢測到的 NIR-II 信號，而細胞本身表現出明亮的 NIR-II 熒光信號，這表明標記細胞中細胞內 FE-4ZW 染料的穩定內化（圖 2E、F）。另一個補充需求是體內細胞追蹤，即使在主要標記信號顯示細胞增殖過程中耗盡后，也能充分檢測增殖的細胞。即使細胞計數呈指數增長（經CCK8測定證實），穩定的NIR-II熒光信號仍可檢測到長達6天（圖2G-I）。上述結果表明，FE-4ZW在細胞中的標記和/或內化可以維持很長時間，從而為利用高對比度NIR-II熒光生物成像在細胞水平上監測復雜的生理過程提供了機會。
圖3. 通過使用 FE-4ZW 進行第二次近紅外 （NIR-II） 熒光成像來跟蹤移植神經干細胞 （NSC） 的位置
通過用 FE-4ZW 預培養 NSC 來證明活體 NSC 跟蹤，然后靜脈注射標記的 NSC。根據既定方案，通過離心仔細收集FE-4ZW標記的發光NSC，隨后靜脈內移植到Balb / C小鼠模型的血液循環系統中（圖3A）。NIR-II熒光信號在立即觀察時提供了清晰的肺部輪廓，從而揭示了標記的NSC首先在肺部積聚。這一結果與之前關于間充質干細胞監測的報道一致。肺內FE-4ZW標記的NSC的NIR-II熒光信號隨著時間的推移逐漸減少，并在72小時時間點后幾乎消失。在整個實驗過程中，肝臟中的NIR-II熒光信號逐漸增加。這些結果證實，靜脈注射后移植的NSC在肺部初始積累后逐漸轉運到肝臟（圖3B-E）。通過跟蹤NSCs進行縱向實時體內成像，可為臨床NSC治療的生理機制和障礙的檢測提供便捷的細胞跟蹤技術。
監測腫瘤細胞在體內的命運對于研究潛在的腫瘤轉移至關重要，但目前的非侵入性策略未能實現這一目標。皮內注射FE-4ZW標記的4T1腫瘤細胞，并觀察到腫瘤細胞（或細胞聚集簇）隨著時間的推移沿著淋巴管遷移（圖3F），從而最終接種在相鄰的淋巴結中（圖3G，H）。通過體外泄漏實驗和細胞增殖實驗來測試FE-4ZW的細胞內穩定性。結果表明，在細胞內化后，FE-4ZW可以穩定地存在于細胞區室中（圖2D-I）。此外，體內NSC細胞追蹤結果顯示，FE-4ZW標記的NSCs在肺內停留了很長時間，并逐漸循環到肝臟。這表明內部化的FE-4ZW沒有與NSC分離。如果FE-4ZW從細胞中分離出來，肺的輪廓將迅速消失（圖3B，D）。圖3F中沿淋巴管自由移動的熒光點的存在表明細胞聚集簇沿著淋巴管運輸，而不是FE-4ZW染料自由移動。本文報道的方法可能適用于監測腫瘤細胞的命運和遷移途徑，從而可以識別腫瘤轉移的關鍵參數。
圖4. FE-4ZW可用于淋巴通路的體內成像和跟蹤腦腫瘤細胞循環
為證明 FE-4ZW 作為造影劑在體內跟蹤 CSF 循環和跟蹤 MLV 和頸部淋巴結中細胞遷移的潛力。圖4A說明了證明FE-4ZW作為腦脊液追蹤器潛力的實驗過程。Cisterna Magna （CM） 的曝光過程、FE-4ZW 的CM 注射和獲取 NIR-II 圖像的過程均在 ISO 麻醉下進行。圖4B顯示了FE-4ZW在腦背側分布的代表性時程圖像，表明FE-4ZW可以通過完整的頭皮進行CM輸送來對腦脊液循環通路進行成像。之后，我們收集了腦組織，并對FE-4ZW在腦組織表面以不同姿勢的分布進行了成像。圖4C顯示CM注射的FE-4ZW沿PVS分布和大腦中動脈周圍的PVS輪廓被清晰地照亮（圖4D）。在證明FE-4ZW 作為所需的 CSF 示蹤劑后，我們通過 CM 注射 FE-4ZW 標記的 GL261 細胞對腦腫瘤細胞遷移進行了體內監測（圖 5E）。注射FE-4ZW標記的GL261細胞后，我們監測了GL261腦腫瘤細胞的行進途徑。對明確的MLV結構進行成像，表明CM注射的細胞沿著MLV隨腦脊液循環而行進（圖4F）。消失的MLV結構意味著注射的細胞具有時間依賴性遷移過程（圖4F，G）。在細胞循環 2 小時后收集 MLV，并通過內部 NIR-II 熒光顯微鏡對 MLV 內細胞的分布進行成像。代表性圖像顯示，注射的細胞主要分布在覆蓋橫竇和嗅球的MLV內（圖4H，I）。然后，我們去除宮頸皮膚，并在成像裝置下暴露CLNs，在允許細胞循環2小時后，周圍的熒光信號表明CLN（sCLNs和dCLNs）可能對中樞神經系統疾病（如腦腫瘤）具有重要功能（圖4J）。使用NIR-II熒光顯微鏡來觀察注射細胞在sCLNs和dCLNs中的詳細分布。被明亮熒光點覆蓋的 sCLN 和 dCLN 意味著GL261 細胞簇已遷移到 sCLN 和 dCLN 中（圖4K）。FE-4ZW標記組的熒光面積大于PBS組，進一步證實了sCLNs和dCLNs充滿了標記的GL261細胞（圖4L）。體外細胞成像和體內細胞跟蹤研究的結果證實，FE-4ZW可以作為細胞造影劑。FE-4ZW的優點包括：（1）充分保持光穩定性，能夠滿足重復的成像要求;（2）高效的細胞標記能力，無需使用CPP，如TAT，CPP的一種。
具有拴系兩性離子泡沫銨末端基團的 NIR-II 熒光發射 S-D-A-D-S 熒光團提供了一種無需 CPP 即可高效標記活細胞的方法。引入的四性離子磺化銨末端基團不僅賦予FE-4ZW優異的水溶性，而且提高了與各類細胞共孵育時與細胞膜的親和力。FE-4ZW用于體內監測移植細胞的命運和腦腫瘤細胞遷移到頸部淋巴結的命運。FE-4ZW染料在細胞中內化并保留在細胞中，基于形態學沒有明顯的細胞毒性。此外，NIR-II熒光染料FE-4ZW可對標記細胞進行長期監測和可視化。此外，盡管NIR-II熒光信號強度隨著原代FE-4ZW標記細胞的增殖而降低，但增殖6 d后的NIR-II熒光信號強度仍可檢測到。
干細胞療法可以通過減少炎癥和調節免疫系統來修復目標位置的受損細胞，因此評估施用的NSC的積累效率至關重要。得益于高NIR-II熒光信號強度和優異的細胞內化學/光穩定性，使用FE-4ZW對NSCs的轉移和生物分布進行了非侵入性追蹤。這是利用不含CPP的有機小分子NIR-II熒光發射熒光團，以監測小動物模型中靜脈注射后干細胞的遷移過程。在腫瘤轉移中，癌細胞可以從原發腫瘤中逃逸，與血液和/或淋巴管一起遷移，并在遠處器官/組織中播種新的腫瘤。本文量身定制的熒光團還提供了一種潛在的方法，可以使用非侵入性途徑在體內可視化此類轉移過程的特定方面。
先前的報道表明，在花青NIR-I熒光發射熒光團上修飾兩性離子基團可以降低熒光團與蛋白質之間的相互作用，從而賦予花青染料更快的腎臟排泄速度。NIR-II 發射熒光團 （FE-4ZW） 的兩性離子 S-D-A-D-S 結構促進了對細胞膜的高親和力和相互作用。所設計的兩性離子泡沫銨基團是FE-4ZW高內化能力的確定因素。FE-4ZW的標記效率高于其他FE染料（FE-2PEG、FE-2PEG2ZW和FE-4SO3Na）。FE-4ZW的細胞攝取機制包括能量依賴性內吞作用和能量依賴性被動轉運。通過培養溫度的降低和額外的內吞抑制劑觀察到的明顯的熒光信號強度消耗表明，內吞作用是FE-4ZW的少數潛在攝取途徑之一。另一種攝取機制可以用以下幾點來解釋：（1）FE-2PEG未能內化為固定細胞，甚至無法將工作濃度提高到50μM;（2）在低溫條件下或在抑制劑存在下進行細胞攝取不能分別抑制FE-4ZW的攝取。此外，使用TPGS/FE-4ZW混合物后，FE-4ZW的肝臟和脾臟積累減少。FE-4ZW為提高體內細胞追蹤的成像質量提供了令人興奮的可能性。為了解決一些未滿足的實際需求，可以考慮以下改進：（1）由于與波長相關的穿透深度，將FE-4ZW的發射波長擴展到NIR-IIb可以進一步提高成像質量;（2）簡化FE-4ZW的合成工藝，使其更適合臨床應用。總體而言，NIR-II 熒光發射熒光團 FE-4ZW 為高分辨率非侵入性跟蹤移植細胞提供了一種便捷的策略，并為在 NIR-II窗口中生產發射熒光信號的高性能細胞成像劑提供了合理的設計策略。
參考文獻
Sun B, Ma R, Wang X, et al. A high‐performance cell‐labeling NIR‐II dye for in vivo cell tracking[J]. View, 2024, 5(2): 20230097.
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近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS
NIR-II in vivo imaging system
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恒光智影
上海恒光智影醫療科技有限公司，被評為上海市“科技創新行動計劃"科學儀器領域立項單位。
恒光智影，致力于為生物醫學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供一體化的成像解決方案。
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