本文要點：在NIR-II區域表現出強吸收性的材料對基于光熱轉換的成像、診斷和治療具有吸引力，因為該區域具有更好的熱效應和更少的水吸收。3,3′，5,5′-四甲基聯苯胺 （TMB） 是 ELISA 中的典型底物，因其氧化產物 （oxTMB） 在 NIR 區域具有光熱活性，因此已在光熱免疫測定中進行了探索。然而，它在 1064 nm（光熱研究中激光波長）處的吸收并不明顯，因此限制了靈敏度的測定。在這里，我們提出了TMB（3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基聯苯胺，2-OCH3）在1064 nm激發光熱免疫測定中具有更高的NIR-II吸收。由于供電子基團可以幫助減少分子的能隙（這里是 -CH3→ -OCH3），2-OCH3的氧化產物與oxTMB相比，表現出顯著的紅移吸收，導致在1064 nm處的吸收系數高出兩倍以上。因此，2-OCH3在光熱免疫測定 （PTIA） 中顯示出比 TMB 更高的靈敏度，前列腺特異性抗原 （PSA） 的檢測限 （LOD） 為 0.1 ng/mL。2-OCH3的可行性通過分析 61 份血清樣本中的 PSA，進一步驗證了基于 PTIA 的診斷。考慮到其優異的光熱性能，2-OCH3可以探索廣泛的光熱應用。

動物活體成像系統

光熱效應是指將光能轉化為熱能，表現出這種效應的材料在生物檢測中得到了廣泛的應用。3′3′，5,5′-四甲基聯苯胺（TMB）是ELISA中占主導地位的顯色底物，已廣泛應用于各種分析檢測過程，其中 TMB在HRP催化劑（HRP-抗體偶聯物）存在下被 H2O2氧化。本文提出了一種新的TMB衍生物，該衍生物增強了其單電子氧化產物的NIR-II吸收，用于改進光熱免疫測定（PTIA）。具體而言，將供電子甲氧基團引入TMB框架的3-、3'-、5-和5'-位置，導致占據分子軌道（HOMO）和未占據分子軌道（LUMO）之間的帶隙變窄，從而產生紅移吸收。兩種候選衍生物，即3,3′，5,5′-四甲氧基聯苯胺（2-OCH3）和3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基聯苯胺（4-OCH3），進行了測試。在 NIR-II 窗口內的 1064 nm 處，2-OCH3的單電子氧化產物， 2-OCH3·+，具有出色的光熱轉換效率 （η = 28.8%） 和 1.48 × 104M-1cm-1的摩爾吸收系數 （ε）,表現出優于 TMB 的性能。當應用于 PTIA 時，2-OCH3前列腺特異性抗原（PSA）的檢測限（LOD）為0.1 ng/mL，是TMB（LOD，0.27 ng/mL）的2.7倍。2-OCH3 的精度基于 PTIA 的 61 份血清樣本也得到了驗證，顯示了其在醫學診斷中的潛力。

圖1. 具有增強 NIR-II 吸收的 TMB 衍生物的設計和驗證

為了提高1064nm處的吸光度，需要吸收的紅移。電子供體基團的引入有助于減小占據分子軌道（HOMO）和未占據分子軌道（LUMO）之間的能隙，從而產生紅移吸收和發射。首先利用理論計算來預測原始襯底（TMB及其衍生物）及其單電子氧化產物（圖1A）的光譜特性。合成兩種TMB衍生物，即3,3′，5,5′-四甲氧基聯苯胺（2-OCH3）和3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基聯苯胺（4-OCH3）。隨后，TMB和合成衍生物的實驗結果證實了上述光譜學預測，即觀察到2-OCH的明顯紅移吸收3和 4-OCH3在TMB上（圖1D）。將反應置于 H2O2-HRP氧化后，相應氧化產物的吸收也大大紅移（圖1E）。例如，2-OCH的摩爾消光系數3(ε = 1.48 × 104M-1cm-1）在1064 nm處比TMB高兩倍以上（ε = 6.06 × 103M-1cm-1）。因此，這種簡單的結構修飾有效地增強了TMB在1064 nm處的吸收，從而在理論上改善了衍生物的光熱響應。

圖2. 基底的光熱性能

接下來，用紅外熱像儀進行評估TMB，2-OCH3和 4-OCH3（之后 H 2O2-HRP氧化）的光熱能力。為了實現這樣的目標，在功率密度為1.2 W/cm2 的  1064 nm 激光器下暴露50秒。如圖 2A所示，2-OCH3和 4-OCH3溫度分別上升了21.7和19.3 °C，大大高于TMB（11.7 °C）。詳細測試表明，在 1064 nm 處，2-OCH3的光熱響應較強可歸因于其高光熱轉換效率（η=28.8%，圖2B，C）和摩爾消光系數（ε = 1.48 × 104M-1cm-1）。在連續五個激光開/關循環中，2-OCH3相對標準差 （RSD） 為 1.6%（圖 2E），也比 TMB （RSD = 3.58%，圖2D）更穩定。當比較信噪比時，2-OCH3在 TMB 和 4-OCH3中均表現出性能 (圖2)此外，2-OCH3的氧化在不同量的HRP存在下具有高度的可重復性，表明2-OCH3是免疫測定的良好底物。因此，2-OCH3被選中進行進一步調查。

圖3. 2-OCH3 氧化產物在 HRP-H2O2 系統中的表征

2-OC3的氧化產物可以以兩種形式呈現：單電子氧化產物（2-OCH3·+），也稱為電荷轉移復合物 （CTC） 和二亞胺二酰胺二分化 （2-OCH3+2).先前的研究表明，如果受體的電子親和力（ΔE）超過了供體（S）的HUMO和受體（S）的LUMO之間的能隙（ΔE）2+），電荷轉移將導致CTC的形成（圖3A）。證實了2-OCH3的氧化產物在 HRP-H2O2系統中確實是 2-OCH3·+，在NIR-II區域表現出很強的吸收性，以改善光熱應用。

圖4. 2-OCH3 基于 PSA 檢測的 PTIA

在2-OCH3氧化產物具有優異光熱性能的基礎上，評價了其在PTIA中的可行性。為了實現這一目標，PSA被用作模型分析物，PTIA的構建是通過在商業PSA試劑盒中用2-OCH3簡單地取代TMB來實現的（圖4A）。在PSA檢測之前，研究了一系列參數，包括pH、H2O2濃度、樣品體積、激光照射時間和緩沖液，以獲得光熱響應。在條件下，溫度響應與PSA濃度在0.31?20 ng/mL范圍內呈線性關系（圖4B）。建立的相關方程為y=1.19x+3.47，相關系數為0.995（圖4B）。與TMB（LOD，0.27 ng/mL）相比，在PTIA中使用2-OCH3（LOD：0.1 ng/mL）顯示出2.7倍的靈敏度提高，從而證實了2-OCH3在PTIA性能。與ELISA類似，基于2-OCH3的PTIA也表現出優異的特異性（圖4C）和長期穩定性。

為了探索基于2-OCH3的PTIA的普遍性，還選擇CEA、IgG和GPC-3作為分析物進行額外驗證。與PSA測定類似，通過用2-OCH3取代TMB來調整用于這些分析物的市售試劑盒。、此外，對于所有這些分析物，觀察到比TMB底物更高的靈敏度。這些結果不僅證明了2-OCH3光熱效率，而且揭示了基于2-OCH3的PTIA在臨床診斷中的多功能性。

圖5. 用基于 PTIA 的 2-OCH3 檢測血清樣本中的人 PSA

人類血清中PSA的檢測。通過檢測臨床血清樣本中的PSA，驗證了基于2-OCH3的PTIA的診斷能力。為了實現這一目標，共收集了61份血清樣本，其中20份來自健康個體，41份來自診斷為前列腺癌癥的患者（表S6），并進行了PTIA和ELISA檢測。如圖5A所示，從兩種方法獲得的結果之間存在高度相關性。受試者操作特征（ROC）分析顯示，PTIA（0.987）的曲線下面積（AUC）略好于ELISA（0.963），表明PTIA對前列腺癌癥診斷具有良好的準確性（圖5B）。根據ROC曲線，ELISA和PTIA的診斷閾值分別為3.3 ng/mL和2.58 ng/mL。混淆矩陣分析表明，PTIA的靈敏度為92.7%（圖5D），而ELISA的靈敏度為85.4%（圖5C）。這些結果證實了基于2-OCH3的PTIA在臨床診斷中的潛力。此外，在3周內對同一樣品進行重復分析后，發現RSD為8.1%，表明基于2-OCH3的PTIA具有良好的穩健性。

本研究提出了一種新的光熱試劑（2-OCH3）基于用甲氧基取代TMB的甲基。與TMB相比，2-OCH3的單電子氧化產物表現出更高的摩爾消光系數 （ε = 1.48 × 104M-1cm-1），從而產生高效的光熱轉換效率（η = 28.8%）。2-OCH3是TMB的衍生物，可直接替代目前ELISA試劑盒中的TMB進行光熱免疫測定。在 PTIA 應用中，2-OCH3在1064 nm激光器的刺激下，表現出比TMB更高的信噪比和靈敏度。由于信號讀出的簡單性和臨床應用潛力，2-OCH3可作為基于 PTIA 的診斷的基材。考慮到2-OCH3出色的光熱性能TMB，在光熱療法中2-OCH3的應用前景廣闊，也可以預期成像和其他相關應用。

參考文獻

Henglin Liu, Xiao Zhang, Xianming Li, and Peng Wu. NIR-II-Absorbing TMB Derivative for 1064 nm-Excited Photothermal Immunoassay. Analytical Chemistry 2024 96 (14), 5633-5639