本文要點：近紅外 I/II 熒光蛋白 （NIR-I/II FPs） 對于體內成像至關重要，但目前的 NIR-I/II FP 面臨著包括稀缺性、發色團成熟要求和發射波長有限（通常< 800 nm）等挑戰。在這里，我們利用合成蛋白質尋求的 NIR-II 染料作為發色團，通過位點特異性親核取代反應與標簽蛋白（例如人血清白蛋白、HSA）共價結合，從而創建概念驗證仿生 NIR-II FP。這種化學蛋白尋找策略可以在溫和的生理條件下完成，無需催化。蛋白質組學分析可識別特異性結合位點（DIII上的Cys 477）。NIR-II FP顯著增強了發色團的亮度和光穩定性，同時提高了生物相容性，從而實現了高性能的NIR-II淋巴造影和血管造影。該策略具有通用性，適用于創建各種光譜分離的NIR-I/II FP，用于實時可視化多個生物事件。總體而言，這種簡單的仿生方法有可能改變基于熒光蛋白的生物成像，并使原位白蛋白靶向能夠產生用于活生物體深層組織成像的NIR-I/II FP。

小動物活體成像系統

圖2. 使用HSA@CO-1080 FP的高性能NIR-II淋巴造影和血管造影

本文研究了 HSA@CO-1080 FP 進行 NIR-II 淋巴造影的能力。HSA@CO-1080 FPs在1064 nm激發下表現出淋巴結定位和淋巴管劃定，優于游離CO-1080發色團。值得注意的是，HSA@CO-1080 FPs在>1500 nm成像窗口保持了出色的淋巴成像能力， 與臨床ICG相比，HSA@CO-1080 FPs也顯示出顯著NIR-II淋巴成像能力和更長的時間窗口。NIR-II FPs隨后成功應用于圖像引導的淋巴結精確解剖和淋巴水腫疾病的高質量可視化（圖2b，c）。總而言之，HSA@CO-1080 FP 是下一代 NIR-II 淋巴造影的主要候選者，解決了臨床ICG 淋巴造影的缺陷/局限性。

血管對于輸送營養和維持全身器官的正常功能至關重要。高質量的血管造影可以幫助外科醫生更有效地識別各種器官的血管病變并評估術后血流恢復情況。因此，我們對HSA@CO-1080 FP進行了一系列臨床前血管造影研究。如圖所示。2d–f、HSA@CO-1080 FP 與 CO-1080 發色團相比，表現出全身和局部（腿部）血管 NIR-II 成像能力。將成像窗口切換到更長的波長，進一步提高了成像質量，特別是在>1400 nm和 > 1500 nm 成像窗口中，幾乎沒有皮膚/背景信號干擾。此外，1064 nm 激發實現了更突出的組織穿透深度和空間分辨率，進一步突出了 HSA@CO-1080 FP 優于 CO-1080 染料的優勢。正如預期的那樣，HSA@CO-1080 FPs可以實現對血管的多/長期監測，不受任何皮膚信號的明顯干擾，這也充分證實了HSA@CO-1080 FPs長期檢測/追蹤血管相關疾病的能力。

由于血管夾層的多樣性和穿支皮瓣設計的復雜性，術后灌注下常導致缺血缺氧引起的局部壞死，使皮瓣壞死成為皮瓣手術和最嚴重的并發癥。不幸的是，目前還沒有合適的成像技術來準確和監測皮瓣功能。HSA@CO-1080 FP 成功地在術后對改良的穿支皮瓣模型進行了高對比度的實時監測，以模擬臨床皮瓣移植。與正常大鼠不同，HSA@CO-1080 FPs能夠清晰地顯示皮瓣模型的術后恢復情況，并準確定位缺血性壞死區域（圖2g）.靜脈注射HSA@CO-1080 FPs，仔細觀察皮瓣區域的血路，發現兩條預留的臀下動脈（IGA）穿支血管先亮起，然后逐漸向上擴散。與建模前的成像結果相比，皮瓣模型組觀察到阻塞血管的打開和血運重建（圖2h）。由于背景信號低和排泄快（能夠重復觀察），HSA@CO-1080 FP成功地可視化了整個皮瓣模型的進展。NIR-II成像證實，進展大致可分為三個階段：術后第2天，遠端皮瓣出現明顯腫脹，轉為深紫色，并開始出現缺血性壞死。術后第4天，遠端皮瓣壞死區加重，呈深褐色。術后第7天，遠端皮瓣出現黑色結痂，伴有干性壞死，與近端有明顯的分界。 HSA@CO-1080 FPs共同具有優異的NIR-II血管造影能力，可促進NIR-II熒光成像技術的早期臨床轉化，并提供一種有效的監測皮瓣功能的方法。

實時多通道NIR-I/II成像系統可同時記錄多個事件，可洞察疾病發生機制，提高成像效率，具有較高的體內和臨床適用性。多種生物事件的集成熒光成像依賴于非串擾熒光探針。本文構建了仿生NIR-I FP（HSA@IR-808和β-LG@IR-780），并將它們與NIR-II FP（HSA@CO-1080和DIII@CO-1080）相結合（圖3a）。合成的NIR-I和NIR-II FP分別在808 nm和1064 nm激發下實現了非重疊發射，提供了優異的雙色成像潛力（圖3b–d）。隨后，使用NIR-I和NIR-II FP進行了一系列體內多通道生物成像實驗。首先，使用HSA@IR-808 FP和HSA@CO-1080 FPs成功實現了集成的多通道NIR-II淋巴成像（圖3e-g）. 這些NIR-I/II FPs成功地實現了腫瘤浸潤前哨淋巴結的精確共定位，從而指導術中有效的手術切除（避免不必要的切除）（圖3f，g）。使用 HSA@IR-808 FP 和 HSA@CO-1080 FP 也實現了無串擾的血管和淋巴系統的集成 NIR-II 生物成像（圖3h），這對于精確的成像引導手術很重要。HSA@CO-1080 FPs（肝膽排泄）和 β-LG@IR-780 FPs（腎排泄）的組合可以同時可視化兩種藥代動力學途徑，而不會出現串擾問題。綜上所述，基于仿生策略構建的NIR-I/II熒光蛋白具有出色的多色生物成像應用潛力，有望實現多種生物事件的綜合實時成像，更好地輔助臨床醫生處理復雜疾病。

圖3. 用于多色活體成像的仿生NIR-I/II FP

參考文獻

Xu, J., Zhu, N., Du, Y. et al. Biomimetic NIR-II fluorescent proteins created from chemogenic protein-seeking dyes for multicolor deep-tissue bioimaging. Nat Commun 15, 2845 (2024).