本文要點：七甲基菁染料可在近紅外(NIR)窗口進行深層組織熒光成像。基準染料ZW800-1的小分子偶聯物已經在人體上進行了測試。然而，由于結構中化學不穩定的C4’-O-芳基連接物容易被生物親核試劑切割，ZW800-1偶聯物的長期成像方案的開發受到限制。本文報告了一種模塊化的合成方法，合成了新型的雙束縛兩性離子七甲基菁染料，染料為ZW800-1的結構類似物，但穩定性大大提高。這種雙束縛染料的NIR-I和NIR-II版本可以與蛋白質結合，如單克隆抗體，而不會導致熒光團降解或染料堆積在蛋白質表面。該熒光抗體結合物在異種小鼠腫瘤模型中顯示出良好的腫瘤靶向性。雙束縛分子設計提供的增強的穩定性將使新的活體近紅外熒光成像實驗成為可能，并可能移植到人類身上。近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS

在NIR-I(700-1000 nm)或NIR-II(10001700 nm)窗口中具有吸收和發射波長的熒光團的在生物醫學成像方面具有很大的應用潛力，因為近紅外光對皮膚和組織有相對較深的穿透能力。幾十年來，吸收/發射波長約為800 nm的臨床近紅外七甲川菁染料吲哚青綠(ICG)一直被用于光學成像和診斷(方案1)。雖然ICG被廣泛應用，但它的最終潛力是有限的，因為其不能與靶向生物分子結合。一種商用NIR-I染料IRdye800CW，分子中含有羧基和多個磺酸鹽，使其可以生物偶聯且具有良好的水溶性。許多生物偶聯物已經被制備并用于體內成像性能的評估。在某些情況下，非目標器官組織中不希望的染料或熒光生物結合物積累被觀察到，這促進了兩性離子染料的發展，因為其可以減少染料與生物表面的結合。一個典型的例子是ZW800-1，它已經用于不同類型的生物偶聯十多年。其染料本身或小分子結合物是非常親水的，通過腎臟從血液中迅速清除。ZW800-1與靶向癌癥組織的環-RGD肽基序的偶聯物，已進入臨床試驗。也有越來越多的報告使用ZW800-1或結構類似物標記用于活體成像和組織學應用的大分子，或生物材料，如細胞表面、水凝膠、納米顆粒、3D打印生物復合材料或用于組織工程應用的細胞外基質生物聚合物。對于這些大多數的應用來說，一個必要的染料性能特性是熒光生物偶聯物的長期化學穩定性，這一要求突出了ZW800-1潛在的化學反應問題；即，由于生物親核試劑對染料的4‘-苯氧基進行親核取代而導致的連接基團斷裂(如方案1中的粉色箭頭所示)。將ZW800-1標記的抗體或納米顆粒樣品在血清中孵育24小時的研究已經觀察到熒光信號的大量損失。在近生理條件下，各種生物親核試劑對染料的分子內和分子間攻擊的可能性很大。由于染料降解造成的熒光信號的損失為縱向實驗帶來了不確定性（縱向實驗旨在測量已標記有染料的植入生物材料的長期降解或運輸）。

如方案1的頂部所示，本文開發了一種NIR-I菁染料的合成方法，這類染料由兩個或四個側翼線性臂立體地屏蔽在平面染料的每個表面上。方案1顯示了本文的重點：即一類性能大大增強的新型雙束縛和可偶聯的NIR-I和NIR-II七甲基菁染料。有關雙束縛染料的文獻包括幾個有機可溶的例子和一個水溶性分子。但這些染料大多數都不在近紅外區域發射，也沒有一種是為水中的生物偶聯而設計的。本文通過制造穩定的雙束縛的ZW800-1解決了其的降解問題，稱之為dsZW800-1。此外，通用的合成方法提供了雙束縛的NIR-II熒光染料dsZW1015，其吸收/發射zui大值>1000 nm，生成了dsZW1015標記的抗體結合物，并成功地用于對小鼠腫瘤進行體內NIR-II熒光成像。

方案1

實驗結果：

1.dsZW800-1的合成

dsZW800-1的合成如方案2所示。合成的關鍵中間體是未束縛染料3，它是在溫和的條件下用苯酚2取代前體1中的4‘-氯原子組裝而成的，其中2的結構上帶有兩個含有末端疊氮基的附加臂。隨后通過皂化反應將3轉化為無束縛染料4，然后在銅的催化下發生疊氮-炔環加成反應共價連接兩條側翼帶，以62%的產率合成了dsZW800-1。

方案2

2.dsZW800-1的分子結構

用標準波譜方法對所有化合物的分子結構進行了表征。ZW800-1和未束縛染料4的化學位移非常匹配，表明二者分子構象相似。相比之下，dsZW800-1的光譜包括多次甲基質子的特定高場化學位移，指示兩條側翼帶中的三唑環的空間磁屏蔽。dsZW800-1的X射線晶體結構也證實了這種分子內屏蔽效應(圖1)。通過與文獻報道的具有4‘-苯氧基取代基的七甲基菁的晶體結構的比較，揭示了dsZW800-1中兩條側鏈引起的兩個獨te的結構特征。一個特征是4‘-苯氧基環相對于七甲基菁熒光團的取向。通常情況下，4‘-苯氧基環的縱軸遠離七甲基菁的垂直面，但在dsZW8001中，4’-苯氧基環被側翼帶強迫與垂直的七甲基菁環對齊，并將其面朝染料的一端旋轉。另一個獨te的結構特征是分子內晶格堆積距離。通常情況下，七甲川菁染料表現出聚次甲基熒光團的滑動同面堆積，典型的分子間距離約為3.5-5.0 ?。但dsZW800-1的側翼條帶增加了每個分子的空間隔離，相鄰熒光染料之間的分子間固態距離為~9 ?。因此，即使dsZW800-1的多個拷貝在自聚集條件下被迫聚集在一起，側翼條帶也確保了足夠的空間分離，以防止染料轉移偶極的強烈耦合。

圖1

3.dsZW800-1的光譜性質和穩定性

表1中染料光物理性質的比較表明，與ZW8001相比，dsZW800-1中的兩條側翼帶并沒有顯著改變zui大吸收和發射波長或熒光峰寬度。有趣的是，dsZW800-1在PBS中的熒光量子產率(11.0%)明顯高于形式上為結構異構體的未束縛熒光團4的熒光量子產率(8.1%)。這一差異表明，dsZW800-1中的約束側翼帶更有效地抑制了從染料激發態到周圍水化殼層的非輻射能量轉移，這通常是高共軛近紅外染料在水中的主要能量弛豫途徑。

接著進行光漂白實驗量化ZW800-1、4和dsZW800-1的光穩定性，即使用帶有620 nm長通濾光片的氙燈照射PBS中的不同染料溶液，并將漂白曲線擬合為單相指數衰減(圖2)。光穩定性的測定順序為4>dsZW800-1>ZW800-1。七甲基菁染料的主要光漂白途徑是光生單線態氧與多次甲基熒光團的雙分子反應，其次是鍵的斷裂和非熒光羰基片段的形成。ZW800-1的相對較差的光穩定性與親電單重態氧和具有給電子體4‘苯氧基取代基的七甲基菁化合物的高反應性一致。4和dsZW800-1的相對增強的光穩定性歸因于近端線性臂或帶提供的空間位阻屏蔽效應，這可能降低氧的光敏化效率和/或抑制隨后與單重態氧的雙分子反應。

表1

圖2

繼續評價每種染料的化學穩定性，將染料與1 mM谷胱甘肽(GSH)混合的溶液在pH 7.4的PBS緩沖液中孵育后，進行一系列光譜實驗。GSH中的親核性的硫醇取代七甲基菁的對苯氧基很容易跟蹤，因為該反應在七甲基菁的吸光度中產生了明顯的紅移。圖3a顯示的是GSH與ZW800-1反應的化學產物。圖3b中的曲線圖比較了這三種染料在含有1 mM GSH的pH 7.4的PBS緩沖液中的穩定性。未束縛的染料ZW800-1和4的半衰期(t1/2)分別為7.1分鐘和27分鐘。相比之下，dsZW800-1與1 mM GSH孵育10小時后，吸收光譜沒有變化，表明沒有發生化學反應(由質譜儀證實)。由于某些細胞內的谷胱甘肽水平可以達到10 mM，將dsZW800-1樣品與10 mM GSH孵育10小時，仍然沒有證據表明dsZW800-1有任何降解。這種對GSH攻擊的保護有效地證明了dsZW800-1中的兩條側翼帶可以有效地完quan阻止生物親核試劑取代不穩定的七甲基菁4‘苯氧基。

圖3

4. 利用dsZW800-1進行抗體標記

谷胱甘肽引起的染料降解實驗表明，未捆綁的ZW800-1和4應當不是蛋白質標記的良好選擇，因為隨著時間的推移，不穩定的七甲川菁4‘苯氧基會被蛋白質表面的親核側鏈切割，例如蛋白表面賴氨酸殘基的ε-氨基。評估ZW8001和dsZW800-1用于蛋白質結合的適宜性的實驗也證實了這一推斷。使用標準的酰胺鍵形成的化學方法將ZW800-1或dsZW800-1連接到山羊IgG抗體或牛血清白蛋白(BSA)上。結果顯示，與dsZW800-1結合的蛋白質比與ZW800-1結合的蛋白質產生更高的標記度(DOL)，并且dsZW800-1標記的蛋白質的熒光強度高3-4倍。著眼于免疫球蛋白偶聯物的穩定性，觀察到IgG-dsZW800-1的NIR信號比IgG-ZW800-1穩定得多。已知的IgG-ZW800-1的化學降解是一個重大的技術限制，而IgG-dsZW800-1的穩定性大大增強。dsZW800-1有望作為一種穩定的近紅外熒光標簽，用來進行測量染料標記細胞或生物材料的降解或運輸的縱向實驗。

5. 使用dsZW800-1進行活體成像

通過將dsZW800-1結合到Panitumab(Pan,一種針對EGFR陽性腫瘤的臨床單抗)上，評估dsZW800-1標記抗體的體內成像性能。圖4a中Pan-dsZW800-1(DOL=3.1)的吸收光譜在772 nm處有一個相對較窄的峰，其激發產生的熒光光譜與游離染料相同。沒有顯示出與dsZW800-1染料在抗體表面的H堆積所對應的吸收峰藍移，而染料的H堆積猝滅會染料的熒光，并可能改變抗體的生物分布。此外，Pan-dsZW800-1在4oC環境下15天的吸收光譜沒有變化，這表明它與臨床上使用的重組Pan具有非常相似的儲存壽命。通過靜脈注射Pan-dsZW800-1在EGFR+JIMT-1(三陰性乳腺癌)荷瘤小鼠身上測試體內成像性能。使用商業活體成像站(IVIS)和NIR-I熒光成像設置觀察到特異性和高攝取率，平均腫瘤與背景比(TBR)在注射后72小時約為8，肝臟信號可以忽略(圖4b，4c)。注射后72小時處死小鼠，器官的NIR-I熒光成像證實了Pan-dsZW800-1具有很高的腫瘤特異性(圖4d、4e)。

圖4

6. dsZW1015的合成

繼續將雙束縛七甲基菁改造為光譜范圍擴大到在NIR-II區(1000-1700 nm)吸收和發射的熒光染料，以改善活體成像。最近商用InGaAs相機的出現極大地促進了NIR-II成像的研究，但目前限制進一步發展的一個因素是缺乏相對較小(MW<2000 Da)的親水性和兩性離子NIR-II染料，這些染料可以附著在靶向生物分子上，如抗體或粘附體，而不形成非熒光染料的H-堆積或改變靶向生物大分子的特異性。NIR-II染料廣泛的疏水表面積使得生產用于靶向生物成像的水溶性生物結合物非常具有挑戰性。一種著ming的NIR-II花青染料FD-1080(方案1)，其結構包括疏水的苯并[c，d]吲哚雜環作為末端單元。在PBS溶液中，FD-1080(及其結構類似物)形成非熒光H-聚集體，因此必須將其配置成與血清蛋白的非共價絡合物，或者包裝在自組裝膠束或脂質體中用于體內成像研究。FD-1080的第二個功能缺陷是缺乏合適的蛋白質結合位點。為了解決這兩個問題，采用了方案3中所示的模塊化合成序列來制備雙束縛帶、帶電平衡的NIR-II染料dsZW1015。關鍵的合成前體是七甲基菁5，它是以商品化試劑苯并[c，d]吲哚-2(1H)-酮為起始的四步法制備的。隨后的兩個步驟引入了可共軛的羧基，并產生了未束縛的七甲川菁7，它被轉化為所需的雙束縛形式dsZW1015。值得注意的是，方案3中列出的所有化合物的非平面結構極大地促進了柱層析的純化。

方案3

7. dsZW1015的光譜性質

NIR-II染料本身具有較低的熒光量子產率，dsZW1015在DMSO中的測量值為0.10%，未束縛的異構體7的熒光量子產率為0.11%，與文獻報道的非極性有機溶劑中的NIR-II染料相當。在水中，NIR-II熒光量子產率更低，但dsZW1015-1在PBS中的熒光量子產率(0.014%)是7的熒光量子產率(0.006%)的兩倍多。亮度的增加可能有兩個原因。一個是NIR-II熒光團對周圍水合球體的空間屏蔽增強(類似于上面的ZW800-1和4的比較)，第二個是染料自聚集方面的顯著差異。吸收光譜表明，在PBS中，未束縛的7在~850 nm處顯示出第二個藍移的非熒光的H聚集吸收帶，而雙束縛的dsZW1015僅在980 nm處以發射單體的形式存在。

8.使用dsZW1015進行活體成像

以dsZW1015的NHS酯為原料，制備DOL=1.2的Pan-dsZW1015結合物。Pan-dsZW1015的吸收光譜只在1000 nm處顯示一個發光單體染料峰(圖5a)，沒有證據表明多個染料的H堆積，在4 oC下15天后光譜性質也沒有變化。dsZW1015應該目前是第yi個與生物大分子偶聯的兩性離子七甲川菁NIR-II染料。在JIMT-1小鼠腫瘤模型上評估pan-dsZW1015的成像性能。活體全身NIR-II熒光圖像顯示，由于附加的疏水性苯并[c，d]吲哚類染料的影響，初始肝臟信號很強(4小時和24小時)。盡管如此，在注射后72小時觀察到明顯的腫瘤靶向，并且偏離目標的信號非常低(圖5b和5c)。成像結果表明，dsZW1015是具有空間屏蔽和平衡電荷的良好結構組合，能夠產生具有特定靶向特性的標記抗體，用于活體對象的有效近紅外成像。

圖5

結論：

綜上所述，本文驗證了雙束縛七甲川菁染料是一類新的高性能、可偶聯的近紅外熒光團。與基準NIR-I染料ZW8001相比，雙束縛類似物染料dsZW800-1顯示出略高的熒光亮度，更好的化學穩定性和兩倍的光穩定性。在使用染料標記抗體的熒光成像方面，dsZW800-1優于ZW800-1，并且將更適合于測量植入染料標記生物材料的長期降解或運輸的縱向實驗。值得注意的是，使用與ZW800-1密切相關的結構的NIR-I七甲川菁染料的熒光探針越來越多，由于存在活性4‘-苯氧基，每個熒光探針都可能有穩定性限制。在這種情況下，都應該直接制備這些NIR-I染料的雙束縛形式，以期改善穩定性和成像性能。模塊化合成方法的一個優點是末端雜環可以直接變化，如制備末端帶有苯并[c，d]吲哚雜環的雙束縛七甲基菁染料dsZW1015，該末端苯并[c，d]吲哚雜環將吸收/發射波長擴展到NIR-II區域。空間屏蔽和平衡電荷的結構組合抵消了dsZW1015中熒光團帶來的疏水性增強，可以生成染料標記的抗體，用于活體小鼠腫瘤的有效NIR-II熒光成像。未來的設計迭代可以在末端雜環中加入合適的官能團，以生產這些雙束縛花青染料的生物響應型版本，用于下一代“turn-on"或“ratiometric"近紅外熒光探針的應用拓展。

參考文獻

Li, D. H.; Gamage, R. S.; Oliver, A. G.; Patel, N. L.; Muhammad Usama, S.; Kalen, J. D.; Schnermann, M. J.; Smith, B. D., Doubly Strapped Zwitterionic NIR-I and NIR-II Heptamethine Cyanine Dyes for Bioconjugation and Fluorescence Imaging. Angew Chem Int Ed Engl 2023, e202305062.

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