本文要點：光聲成像(PAI)/第二近紅外窗口熒光成像(NIR-II FI)雙模式成像技術由于具有較高的空間分辨率和信噪比，在檢測腫瘤組織和前哨淋巴結(SLN)方面具有廣闊的應用前景。本研究以苯并噻二唑為電子受體，開發了兩種聚集誘導發光劑(AIEgens)(C-NTBD和O-NTBD)，首ci將PAI/NIR-Ⅱ FI應用于神經內分泌腫瘤(NENs)及其SLNs的診斷和治療。其中，C-NTBD納米粒子具有較好的PAI和NIR-II熒光性能，其zui大吸收波長位于732 nm，發射峰位于1042 nm。在荷NENs裸鼠模型中，在PAI術前成功定位NENs后，再用NIR-II FI檢測SLN。在C-NTBD納米粒子的NIR-II FI引導下，發現并精確地切除了位于胸壁的遠離原發腫瘤部位的直徑為1 mm的SLN。

背景：神經內分泌腫瘤(NENs)是一組起源于肽能神經元和神經內分泌細胞的高度異質性的惡性腫瘤，易發生淋巴結轉移。現代影像技術仍然無法準確識別微小的NENs病變組織和SLNs(毫米級)。為了克服單一成像模式的不足，多模式成像技術被開發出來，以綜合兩種或兩種以上成像模式的優點。由于PAI的高空間分辨率和NIR-II FI的高信噪比的優勢互補，PAI/NIR-II FI雙模態成像技術在腫瘤組織和SLNs的檢測中顯示出巨大的應用前景。術前PAI成功定位腫瘤組織后，術中NIR-II FL可準確檢測SLNs，預防性剝離SLNs，降低腫瘤殘留率。然而，在以往的研究中，PAI/NIR-II FI主要應用于腫瘤的診斷，而其在腫瘤和SLN診斷中的應用研究較少。

研究內容：本研究以苯并噻二唑為電子受體，開發了兩種聚集誘導發光劑(AIEgens)(C-NTBD和O-NTBD)，首ci將PAI/NIR-Ⅱ FI應用于神經內分泌腫瘤(NENs)及其SLNs的診斷和治療。其中，C-NTBD納米粒子具有較好的PAI和NIR-II熒光性能，其zui大吸收波長位于732 nm，發射峰位于1042 nm，血管造影分辨率高達20μm。在C-NTBD納米粒子的實時NIR-II FL引導下，發現并精確地切除了位于胸壁的遠離原發腫瘤部位的直徑為1 mm的SLN。這種雙模態成像技術可以提高術中切除SLNs的準確性，改善患者的預后，為準確治療NENs提供新的策略。(Scheme 1)

首先，作者進行了分子設計和合成，然后進行了理論計算。為了探索更多的C-NTBD和O-NTBD的結構信息，用Gaussian 09 W程序，用B3LYP/6-31G*基組模擬了它們的分子優化結構和分子軌道能級信息。C-NTBD和O-NTBD都表現出扭曲的立體結構，這可以有效地防止聚集態的堆積(例如，π-π堆積)。C-NTBD和O-NTBD在π電子傳遞單元和電子受體苯并噻二唑之間的二面角分別為48.1?和38.7?(圖1B)。C-NTBD的分子結構比O-NTBD更扭曲，這更有利于分子激發態能量通過輻射途徑耗散。如圖1C所示，C-NTBD和O-NTBD的zui低未占分子軌道(LUMO)電子密度都主要集中在苯并噻二唑部分，而它們的zui高占據分子軌道(HOMO)的軌道能級沿分子骨架均勻分布。

Figure 1

然后作者研究了C-NTBD和O-NTBD的光物理性質。C-NTBD的吸收峰和摩爾消光系數(ε)如圖2a所示。O-NTBD與C-NTBD相比吸收峰紅移，因為烷氧基比乙基具有更強的供電子能力，這一結果與激發態計算相一致。作者還研究了聚集態分子的吸收性能。將9倍體積的水加入到DMSO溶液中(水的分數為90%)，制備了分子聚集體。如圖2B所示，C-NTBD在聚集體中的吸收峰移動到了746 nm，O-NTBD在聚集體中的吸收峰也發生了移動(795 nm)。C-NTBD在808 nm處的ε比O-NTBD在溶液和聚集態下的高，這有利于C-NTBD更多地吸收光能，轉化為近紅外-II熒光和熱。作者使用靈敏度更高的近紅外成像系統(1000nm LP濾光片)來測定C-NTBD和O-NTBD的ΦPL。如圖2C所示，O-NTBD的ΦPL為0.83%，而C-NTBD的ΦPL為0.22%。作者還測量了它們在不同比例的DMSO/甲苯體系中的光致發光強度。這兩個分子都顯示出典型的AIE特征，因為熒光強度隨著甲苯組份(Ftol)的增加而增加(圖2D)。

Figure 2

接下來，作者對C-NTBD和O-NTBD進行PEG化修飾(圖3A)得到C-NTBD NPs和O-NTBD NPs，并對其進行表征。動態光散射(DLS)結果表明，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs平均流體動力學直徑分別為142.49 nm和129.34 nm(圖3B)。TEM結果表明，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs具有均勻的球形結構，平均直徑分別為139 nm和111 nm(圖3B)。與C-NTBD NPs相比，O-NTBD NPs的zui大吸收波長(776 nm比732 nm)和發射峰(1110 nm比1042 nm)顯著紅移(圖3C)。在808 nm激光激發和1000 nm LP濾光片上，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs都顯示出顯著的熒光信號，其中C-NTBD NPs發射出更強的熒光信號(圖3D)。C-NTBD NPs在9 mm雞胸肉覆蓋下顯示出明顯的NIR-II熒光信號，而O-NTBD NPs在6 mm雞胸組織覆蓋度下的熒光信號非常微弱(圖3D)。這些結果表明，與O-NTBD NPs相比，C-NTBD NPs的NIR-II成像能力更好。

Figure 3

隨后，作者用熱成像儀研究了C-NTBD納米顆粒和O-NTBD納米顆粒在不同濃度下隨808 nm激光照射時間的溫度變化，進一步評價了它們的光熱轉化性能(圖4a和圖4b)。在808 nm激光(0.5W/cm2)照射下，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs的溫度都迅速上升，并在激光照射5分鐘后達到穩定水平(圖4a&b)。C-NTBD納米粒子和O-NTBD納米粒子表現出濃度依賴的光熱效應。C-NTBD納米顆粒表現出比O-NTBD納米顆粒更好的光熱性能(5min的ΔTmax分別為49.8?C和43.6?C)(圖4C)。此外，C-NTBD納米顆粒和O-NTBD納米顆粒的光熱性能在5次加熱-冷卻循環后保持不變，證實了它們良好的光熱穩定性(圖4D)。

Figure 4

作者進一步研究了它們的PA性質。C-NTBD NPs和O-NTBD NPs分別在755 nm和785 nm的激光波長下獲得了zui大的PA強度。在760 nm激光照射下，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs的PA信號都隨著AIEgens濃度的增加而增強，并在3.125-100μM的濃度范圍內呈線性關系(圖5a和b)。C-NTBD納米粒子在體外表現出比O-NTBD納米粒子更好的PAI性能，這與其光熱性能是一致的。如圖5C所示，在給藥C-NTBD NPs(0 h)之前，腫瘤部位有微弱的PA信號。靜脈注射C-NTBD NPs后8h達到zui大值，提示注射后8h是STC NENs進行PAI的zui 嘉時間點(圖5C和圖5D)。這些結果證實C-NTBD NPs可作為NENs的有效的高對比度PAI探針。

Figure 5

作者還通過靜脈注射在BALB/c裸鼠大腦皮層血管中進一步評估了C-NTBD NPs用于NIR-II FI的體內性能。如圖6A所示，靜脈注射C-NTBD NPs 5分鐘后，大腦皮質血管顯示明亮的近紅外-II熒光信號(由1000 nm LP濾光片采集)，成像深度為300μm，清楚地顯示了大腦皮質豐富的血管網絡。為了進一步評估血管成像的分辨率，選擇其中一個大腦皮層區域進行放大研究(圖6B)。大腦皮質微血管的熒光信號仍然清晰明亮，分辨率高(20μm)(圖6D)。這些結果證明了C-NTBD納米粒在體內具有顯著的NIR-II熒光能力。

Figure 6

最后作者在體內NIR-II FI引導下對荷瘤裸鼠模型進行了SLNs手術。瘤內注射C-NTBD NPs后，用NIR-II實時成像系統(808 nm激光激發，1000 nm LP濾光片)對荷瘤裸鼠全身進行成像。注射后1分鐘，除腫瘤部位可見明亮信號外，SLN的信號以及兩者之間的淋巴引流信號也隱約可見(圖7B)。值得注意的是，其中一個SLN位于胸壁，遠離原發腫瘤部位，在常規SLN解剖中極易被忽視。15分鐘后(圖7C)，鄰近SLN、遠端胸壁SLN的信號及兩者之間的淋巴引流信號更加明顯，在注射后1h內，信號強度隨時間增加(圖7D)。然后，作者在已建立的NENs模型中實施NIR-II FI引導下的SLNs手術。首先切除SLNs區域的表皮，然后再次進行NIR-II FI。與去除表皮前相比，SLNs信號亮度增加(圖7e和f)，表明外科手術位置是準確的。隨后，在NIR - II熒光信號的引導下，SLN被精確地移除(圖7g )。手術時間約為10分鐘，分離淋巴結的大小約為1mm(圖7h和i)。切除腫瘤和SLN后進行H&E和免疫組織化學(IHC)染色，以確認切除的腫瘤是NENs及其SLN(圖7j-o )。

Figure 7

總結：作者設計和合成了兩種以苯并噻二唑為電子受體的NIR-II類發光試劑(C-NTBD和O-NTBD)。為了使疏水的C-NTBD和O-NTBD具有良好的水分散性，采用納米沉淀法制備了C-NTBD NPs和O-NTBD NPs 。體外研究表明，與O-NTBD NPs相比，C-NTBD NPs具有更好的光熱、PAI和NIR-II FI性能。以C-NTBD NPs為造影劑，首ci將PAI/NIR-II FI應用于神jing，病變組織和SLN的識別和治療。在C-NTBD納米粒子的實時NIR-II FL引導下，甚至發現并精確地切除了位于胸壁的遠離原發腫瘤部位的1 mm SLN。這項工作為NENs的臨床治療提供了一種很有前景的方法。

參考文獻

doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121780

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近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

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顯微鏡 - 近紅外二區高分辨顯微系統，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

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