本文要點： 生物組織的光散射限制了活體動物體內高分辨率光學顯微鏡成像的穿透深度。減少光散射和增加成像深度的一種有效方法是將激發和發射波長擴展超過1000nm的第二個近紅外窗口(NIR-II)。作者開發了具有生物相容性的核殼結構PbS/CdS量子點，發射于1880nm，以及超導納米線單光子探測器SNSPD用于超過1700nm信號的檢測，使單光子激發熒光成像窗口位于1700-2000nm(NIR-IIc)范圍——這是迄今為止最長的單光子激發和發射。通過完整的小鼠頭部的NIR-IIc共聚焦熒光成像深度達到1100μm，并能夠在沒有進行任何手術的小鼠腹股溝淋巴結中進行無chuang的細胞分辨成像，實現了直徑小至6.6μm的高內皮小靜脈、CD169+巨噬細胞和CD3+T細胞的體內分子成像。近紅外二區小動物活體熒光成像系統-MARS

背景：限制光學成像進入深層生物組織的因素之一是吸水率；由于O-H鍵彎曲的振動泛音模式，水在1,445nm處出現了一個局部吸收峰。在800-1400nm范圍內，光吸收相對較低，大腦等組織的成像受散射影響為主，可以在厘米深度成像，但由于光散射，分辨率會損失。水的吸光度和光散射都會影響NIR-IIb窗口(1500-1700nm)的成像。在1700nm以上，光散射進一步減少，但對水的吸光度增加。到目前為止，還沒有關于波長大于1700nm的單光子激發熒光成像生命系統的報道，由于缺乏具有足夠的量子產量/亮度的生物相容性熒光探針，而且InGaAs相機對NIR-IIc/NIR-IId范圍內波長大于1700nm的光不敏感。

實驗內容：作者合成了發射峰在2009nm的硫化鉛量子點。然后通過陽離子交換方法在硫化鉛核上生長一個硫化鎘殼，以保護硫化鉛核不被降解。這使核心的發射峰位移到1880nm。為了將QDc從有機相轉移到水相，作者將親水聚合物交聯網絡(P3涂層)涂層在QDc上，使其在生理環境中具有生物相容性，通過膽道排泄，沒有明顯的毒性。最終P3-QDc在NIR-IIc中的峰值發射波長為1820nm。可檢測1550~2000nm波長的探測器SNSPD也克服了InGaAs探測器1700nm的檢測限制。

作者首先成像充滿水懸浮液的50-μm直徑毛細管，使用發射峰值在NIR-IIb的P3-QDb或NIR-IIc的P3-QDc，浸在5%脂質溶液內，模擬小鼠腦組織的血管。SNSPD的SBR，分辨率比InGaAs相機高，NIR-IIc的波長下, SNSPD可以實現更深深度的成像，1650nm激發下，可在4.4mm下分辨毛細管，比1540nm激發NIR-IIc成像和1319nm激發NIR-IIb成像更深。（圖2a-c）1900nm以上的熒光信號隨著水層的增加而減少，說明水對熒光吸收的影響。（圖2d）

圖2

作者通過完整的小鼠頭部進行了血管的NIR-IIc無chuang三維共聚焦成像，解決了三維的老鼠頭部層成像(圖3b)。觀察到通過腦膜連接顱骨和大腦皮質的血管狀通道。這些通道被證明對大腦對損傷和感染的免疫反應是重要的。作者比較了SNSPD與商業光電倍增管(PMT)，相對于PMT，SNSPD的SBR和成像深度都更高。對于1319nm激光激發下的NIR-IIb成像，基于SNSPD的共聚焦顯微鏡分辨了PMT未檢測到的小毛細血管，并在更大的成像深度下允許更高的空間分辨率(圖3c，di一柱和第二柱；圖3d)。在1540nm的激光激發下，使用SNSPD在NIR-IIc窗口的成像比在1319nm的NIR-IIb區域分辨率更好。比較1650nm和1540nm激光進行NIR-IIc成像；1650nm激發下FWHM量化的空間分辨率明顯提高(圖3c，第三柱和第四柱；圖3d，e)。只有1650nm激光激發的NIR-IIc成像允許在超過1,100μm的深度成像小鼠頭部，而且對比度zui高（圖3d,e）。

圖3

作者通過完整的小鼠皮膚對淋巴結進行了成像，這與以前通過侵入性手術安裝透明窗口的活體顯微鏡檢查法不同。首先對小鼠腹股溝淋巴結中HEV上的PNAd進行無chuang體內NIR-IIc分子成像。將結合了P3-QDc的抗MECA-79抗體(aMECA-79-QDc)注射到小鼠體內，24小時后注射有機探針p-FE（NIR-IIb區成像血管）。在NIR-IIb和NIR-IIc中進行InGaAs寬視場成像和SNSPD共聚焦顯微鏡成像，觀察到aMECA-79-QDc的發射以及標記的血管(圖4b,c)，明顯看到SNSPD的背景信號更低。而注射沒有無偶聯aMECA-79的P3-QDc的對照組小鼠的淋巴結中未檢測到QDc發射信號。高分辨率三維共聚焦成像中，只有HEV被aMECA-79-QDc標記，說明了aMECA-79-QDc的靶向性(圖4d)。P3-QDc和aMECA-79-QDc的穩定性允許在4天內對淋巴結中HEV成像(圖4e)。

圖4a-e

為了實現細胞分辨率的體內無chuangNIR-IIc共聚焦顯微鏡成像，對完整小鼠淋巴結中的CD169（巨噬細胞表達）和CD3（T細胞表達）進行雙色分子成像。作者將CD169抗體結合到QDs(aCD169-QDa)，CD3抗體結合到P3-QDc(aCD3-QDc)。注射后1天，寬視場圖像顯示淋巴結中存在較強的aCD169-QDa和aCD3-QDc信號(圖4f)。雙色大面積共聚焦顯微鏡顯示，被aCD169-QDa標記的CD169+巨噬細胞勾畫出包膜下竇；由aCD3-QDc標記的CD3+T細胞位于淋巴結內部的T細胞區(圖4g，h)。未標記的B細胞濾泡也可以被識別出來(圖4h中的黑暗區域)，因為它們靠近巨噬細胞層，并被T細胞包圍。500μm深度下仍可以看到CD3+T細胞在1,650nm激發下標記在細胞的外部(圖4i)。在體外，用DRAQ7染料對細胞核進行染色。DRAQ7和aCD3-QDc在體外共聚焦下可清晰分辨細胞被aCD3-QDc勾畫出來(圖4j)。這些結果建立了體內完整淋巴結下細胞分辨的無chuang NIR-IIc共聚焦顯微鏡成像。

圖4f-j

總結：作者開發了發射峰超過1700nm（NIR-IIc）的量子點探針和可探測1700nm以上信號的探測器SNSPD，增加了近紅外成像的穿透深度，可通過完整的小鼠頭部成像腦膜下的腦血管，可分辨淋巴結內的T細胞和吞噬細胞。

參考文獻

doi.org/10.1038/s41565-022-01130-3

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近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優于3um

熒光壽命 - 分辨率優于 5us

高速采集 - 速度優于1000fps （幀每秒）

多模態系統 - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區高分辨顯微系統，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

          上海恒光智影醫療科技有限公司，專注于近紅外二區成像技術。致力于為生物醫學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供*的、一體化的成像解決方案。自主研發近紅外二區小動物活體熒光成像系統-MARS。

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