本文要點：食管鱗狀細胞癌 (ESCC) 死亡率高，其主要治療方法是手術切除。由于高度侵襲性，ESCC 在食管壁和淋巴系統中的浸潤率很高，使得跟 zhi性手術對 ESCC 來說是一項艱巨的挑戰。目前，ESCC 患者的預后較差，5 年生存率為 30.3% 。因此，明確界定細微病變對于改善 ESCC 患者的預后至關重要。在本研究中，旨在探討 EGFR （表皮生長因子受體）靶向抗體探針的 NIR-II 手術導航對 ESCC 的價值。首先，結果證實 EGFR 在 ESCC 細胞系和樣品中過表達。然后構建了 NIRF 探針西妥昔單抗-IR800。體外和體內研究顯示 EGFR 抗體探針在 ESCC 中的特異性攝取。此外，西妥昔單抗-IR800 用于 NIR-I 和 NIR-II 窗口中原位 ESCC 模型的手術導航。因此，該研究結果強調 NIR-II 成像可以幫助識別微轉移。

首先，檢測 EGFR 在患者腫瘤中的臨床相關性，并通過 IHC 研究 127 名原發性 ESCC 患者和相應淋巴結中的 EGFR 表達。如圖 1A 和 C 數據顯示，在 94.49% 的原發性 ESCC 患者和 90.63% 的 LNM 患者中發現了陽性 EGFR 染色。EGFR 在 ESCC 組織中的過表達率達到73.23% ，在 LNMs 中達到81.25% 。如圖 1B 和D數據顯示，腫瘤組織中和轉移性淋巴結中 EGFR 的表達顯著高于相鄰正常組織（H 評分）。如表 1 所示，EGFR 表達與年齡、性別、腫瘤淋巴結轉移、病理分期或組織學分化無關。

圖 1. ESCC 患者腫瘤組織和淋巴結的免疫組織化學（A,C）ESCC 患者的代表性 EGFR 染色圖像（A）腫瘤組織和（C）淋巴結的代表性 EGFR 染色圖像（-：陰性染色，+：弱陽性，++：中等陽性，+++：強陽性） (B) 正常組織和腫瘤組織的 H 分數比較（H值大于100被歸為“過度表達"）(D) 正常和轉移性淋巴結的 H 評分比較

表1：ESCC 中的 EGFR 表達特征

其次，研究EGFR的表達和西妥昔單抗與癌細胞的結合。使用蛋白質印跡評估 ESCC 細胞中的 EGFR 蛋白表達（圖 2A）。定量分析顯示 EGFR 蛋白在 KYSE-30 中的表達zui 高。因此，KYSE-30 被選為 EGFR 陽性細胞系進行體外和體內研究，相反卵巢癌細胞系 A2780 被用作陰性對照（圖 2B）。共聚焦成像顯示 EGFR 蛋白主要分布在 KYSE-30 細胞的膜和細胞質中，而在 A2780 細胞中檢測不到該蛋白（圖 2E）。西妥昔單抗的體外特異性是通過流式細胞術評估，熒光強度峰的相對位移表明西妥昔單抗-IR800 與 EGFR 陽性 KYSE-30 細胞結合，但不與 EGFR 低表達的 A2780 細胞結合（圖2C）。這些結果表明 EGFR 可作為 ESCC 成像的有吸引力的靶標。正如預期的那樣，西妥昔單抗和西妥昔單抗-IR800的結合能力沒有顯著差異，表明染料標記后西妥昔單抗的結合不受影響（圖2C，D）。共焦顯微成像用于評估探針與細胞的結合，EGFR  陽性細胞系 KYSE-30 與西妥昔單抗-IR800 在室溫下孵育 0.5 h 時表現出更強的膜熒光，這進一步表明西妥昔單抗-IR800 的細胞結合是由 EGFR 介導的（圖 2E）。

圖 2. EGFR 的表達和西妥昔單抗與癌細胞系的結合 (A) 蛋白質印跡用于確定 ESCC 細胞系和陰性對照卵巢癌細胞系中的 EGFR 表達 (B) ESCC 細胞系中 EGFR 表達的量化 (C, D) 流式細胞儀分析和量化染料標記抗體或裸抗體的細胞結合。通過染料標記的抗體或裸抗體的平均熒光強度 (MFI) 與 IgG1 的 MFI 的比值計算定量 (E) A2780 和 KYSE-30 細胞中 EGFR 抗體的細胞結合的共聚焦熒光成像

接著，對西妥昔單抗-IR800 和 IgG1-IR800 在 EGFR 陽性皮下腫瘤模型中成像。EGFR 陽性腫瘤小鼠靜脈注射西妥昔單抗-IR800后，熒光在上腹部積聚(0.5 h)，并在 72 小時達到峰值。TBR 從 6 小時的 1.58 ± 0.09 增加到 120 小時的 3.95 ± 0.10。然而，注射 IgG1-IR800 在腫瘤中產生微弱的熒光，自 24 小時以來有所下降。西妥昔單抗-IR800 產生的jue dui熒光值和 TBR 明顯強于對照探針（圖 3A-C）。對小鼠器官和腫瘤進行體外熒光成像，結果表明接受西妥昔單抗-IR800 的腫瘤比對照組熒光信號更強（圖 3D，3E）。IHC 染色證實了 KYSE-30 腫瘤組織中 EGFR 的高表達和成像結果（圖 3F）。冰凍切片免疫熒光顯示注射西妥昔單抗的腫瘤內的熒光信號 IR800 強于 IgG1-IR800，表明靶向探針在腫瘤組織中的特異性積累。

圖3. 注射西妥昔單抗-IR800或IgG1-IR800 的 KYSE-30 皮下腫瘤的體內/體外成像和探針分布 (A) 裸鼠注射前后的體內成像 (B) 腫瘤熒光強度的量化 (C) TBR 的量化。TBR，腫瘤與背景的比率 (D) 在120 小時注射探針后腫瘤和主要器官的離體成像(1 心臟、2肝臟、3脾臟、4肺、5腎臟、6胃、7腸、8結腸、9腫瘤、10腦、11胰腺）(E) 量化腫瘤和主要器官的平均熒光強度 (F) KYSE-30 腫瘤組織和肌肉的 IHC 染色 (G) 使用免疫熒光檢測探針和 EGFR 蛋白的分布

緊接著，對 EGFR 陽性和 EGFR 陰性皮下腫瘤模型進行紅外成像。西妥昔單抗-IR800 的特異性在 EGFR 陰性 A2780 腫瘤中進一步評估，并與 EGFR 陽性 KYSE-30 腫瘤進行比較。注射靶向探針后，KYSE-30 腫瘤表現出強烈的熒光，MFI 和 TBR 分別在 48 和 72 小時達到峰值。但 A2780 細胞對西妥昔單抗-IR800的攝取較弱，6 h后 MFI 和 TBR 均顯著低于 KYSE-30 腫瘤（P < 0.05）。根據體內性能，體外成像也顯示 KYSE-30 和 A2780 腫瘤之間存在顯著差異（圖 4A+E）。免疫熒光成像和 IHC 染色顯示 KYSE-30 腫瘤中 EGFR 的表達明顯強于 A2780 腫瘤（圖 4F，G），這表明 EGFR 的細胞表達在腫瘤中得以維持。此外，西妥昔單抗-IR800 在 KYSE-30 細胞中的分布與 EGFR 染色共定位并且強于 A2780 細胞（圖 4G）。這些發現進一步暗示目標探針的吸收是由 EGFR 誘導的。

圖 4. 注射西妥昔單抗-IR800 的 KYSE-30 和 A2780 皮下腫瘤的體內/體外成像和探針的分布 (A) 注射西妥昔單抗-IR800 前后的裸鼠體內成像 (B) 腫瘤熒光強度的量化 (C) TBR 的量化(D) 在 96 小時注射探針后腫瘤和主要器官的離體成像 (1 心臟、2 肝臟、3 肺、4 脾臟、5 腎臟、6 胃、7 腸、8 結腸、9 皮膚、10 腫瘤、11胰腺，12 腦） (E) 量化腫瘤和主要器官的平均熒光強度 (F) 使用免疫熒光檢測探針和 EGFR 蛋白的分布 (G) KYSE-30 和 A2780 腫瘤組織中 EGFR 蛋白的免疫組織化學染色

然后，進行 NIR-I 和 NIR-II 引導手術并比較，以驗證西妥昔單抗-IR800 在 ESCC 中的價值。原位 ESCC 模型 (n = 9) 用于影像引導手術。手術導航前，9.4T T2加權 MR 圖像用于掃描上腹部，顯示食管下段有高信號腫塊。食道壁增厚和管腔變窄與人類食道癌的特征一致（圖 5A）。在探針給藥后 72 小時進行了剖腹探查，發現食管下壁有一個局灶性腫塊。相應位置的生物發光信號進一步證實了原位 ESCC 成功建立（圖5B）。進行了原位 ESCC 腫瘤的 NIR-I 和 NIR-II 手術導航。NIR-II 的 TBR 遠高于 NIR-I (2.11 ± 0.46 vs 1.58 ± 0.31, P <0.05)。TLR（腫瘤與肝臟的比率）的灰度值與 TBR 的灰度值一致（1.82 ± 0.44 vs 1.37 ± 0.25，P < 0.05）（圖 5C）。采集原位腫瘤進行病理分析，包括 HE 和 IHC 染色。腫瘤侵犯食管肌層，鄰近組織有微小浸潤。IHC 染色表明 EGFR 在原位腫瘤中高表達（圖 5D，E）。

圖 5. 原位食管鱗狀細胞癌的手術導航 (A) MR 成像顯示食管下壁增厚和管腔變窄 (B) 用 KYSE-30-L 細胞構建的原位 ESCC 模型通過手術探查和生物發光得到證實 (C)NIR-I 和 NIR-II導航以及 ESCC 在探針注射后 72 小時的 TBR 和 TLR（D，E）原位 ESCC 的 HE 和 IHC 染色

最后，測量 1-5 毫米的生物發光陽性結節散布在原位 ESCC 周圍，這意味著微轉移（圖 6A，B）。NIR-II 成像突出了這些細微病變中的大部分，其中一些通過肉眼檢查和 NIR-I 成像無法辨別。連續灰度定量分析顯示 NIR-II 中有尖銳的信號峰，與轉移灶相對應，而這些病灶的信號峰在 NIR-I 中較粗或丟失。定量分析顯示，NIR-II 中隱匿性轉移病灶的灰度值是 NIR-I 的 2.8 倍（62.6 vs 22.2），表明 NIR-II 成像在識別 ESCC 結節方面比 NIR-I 更有效，因為原位 ESCC 中的 TBR 較高（圖 6C，D）。根據生物發光和 HE 染色，NIR-II 在檢測轉移灶的靈敏度方面優于 NIR-I  (圖 6E-G)。此外，NIR-II 在原位 ESCC 附近劃定了細微結節, 連續灰度定量分析也顯示了與原發腫瘤相鄰的小信號峰。連續灰度定量分析無法區分微小病變與原發性ESCC的信號，這些數據表明 NIR-II 比 NIR-I 具有更好的空間分辨率。

圖 6. 轉移性結節的手術導航 (A) 剖腹術顯示食管下壁增厚 (B) 生物發光成像顯示食管下段腫瘤和腹腔轉移（C，D）箭頭對應于 NIR-I 和 NIR-II 區域的橫截面熒光強度分布的位置和方向，定量分析結果表明，與 NIR-I 相比，NIR-II 成像對 ESCC 轉移的區分更有效 (E, F) 小轉移瘤的 HE 和 IHC 分析 (G) NIR-I 和 NIR-II 檢測到的轉移灶數量

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