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杯墊CFG上方的搖瓶用于讀取光學傳感器

     研究了不同栽培條件下谷棒狀桿菌和兩種不同白喉棒狀桿菌培養物中缺氧的影響。進行實驗以表征低氧濃度對氮代謝的特定酶 - 銨轉移酶谷氨酸脫氫酶（GDH）的影響。Oxgyen監測使用PreSens的氧氣儀Fibox 3進行。所有測試的棒狀桿菌培養物的生長速率取決于氧氣供應，并且可用的氧氣越多，生長速率就越高。所研究的GDH活性似乎不受谷氨酸C.低氧水平的影響。在白喉衣原體培養物中，GDH活性在某些條件下增加，但只能確定非常低的活性值，這可能不顯著。

     銨的同化，被稱為谷氨酸C.的氮源，主要通過NADPH依賴性谷氨酸脫氫酶（GDH）完成。該酶將銨轉化為L-谷氨酸，這使得GDH成為一種生物技術上重要的酶，因為食品工業需要大量谷氨酸作為增味劑。因此，一個目標是提高GDH的效率。在谷氨酸梭菌和白喉梭菌等需氧細菌中，氧限制會影響新陳代謝，也可能損害GDH活性。在T. Müller[2]先前的研究中，可以觀察到在氧氣排除下谷氨酸C. gdh的轉錄減少。以下實驗進一步研究了缺氧對谷氨酸衣原體和白喉梭菌培養物生長速率、GDH活性和GDH轉錄的影響。測試具有不同培養體積和振蕩速度的不同培養條件。Fibox 3與化學光學氧傳感器一起用于在整個培養期間培養物中的非侵入性氧監測。

材料與方法

    實驗使用300 mL擋板玻璃搖瓶，其中一些在內底壁上附有氧傳感器點（PreSens）。杯墊CFG是一個適配器，放置在傳感器點正對面的搖瓶下方，并通過PreSens連接到氧氣計Fibox 3以讀取傳感器響應。在整個培養過程中以30秒的采樣率監測和記錄氧氣濃度。本研究使用了谷氨酸梭菌ATCC13032野生型菌株和兩種白喉梭菌野生型菌株DSM44123和DSM43988[1]。為了檢查不同培養條件下的耗氧差異，在125 rpm的振蕩速度下，體積為25 mL、50 mL和100 mL，并在100 rpm和150 rpm的振蕩速度下測試了另外兩種50 mL體積的培養物。對于每一系列測試，在搖瓶中接種四個平行培養物。在每個系列中，取三個15mL樣品，每個樣品來自單獨的培養容器，用于谷氨酸脫氫酶活性測量和RNA雜交：0.5小時，2.5小時和6.5小時后。剩余的搖瓶裝有用于氧氣監測的傳感器點。gdh DNA片段通過集落PCR擴增，隨后通過凝膠電泳純化，并用NucleoSpin®提取物試劑盒（Macherey-Nagel，Düren）提取。GDH活性按照T. Müller[2]的描述進行測量，并用以下公式計算：

活動 = （ΔA x V） / （ε x t x m x d）

     Delta A是吸光度降低，V是總反應體積。Epsilon是消光系數，t是反應時間，m蛋白在反應混合物中（mg）和d層厚度。用Roti-Quant®在oD下測量反應混合物中的蛋白質595.使用NucleoSpin® RNA II-Kit （Macherey-Nagel， Düren）進行總RNA的分離。標記的RNA探針的合成和RNA雜交按照E. H?nssler的描述進行[3]。

圖1：不同體積（A）和不同振蕩速度（B）的谷氨酸梭菌培養物的氧濃度和oD。

圖2：谷氨酸梭菌培養物中的氧濃度和GDH活性（A）;白喉衣原體DSM44123和DSM43988培養物中GDH活性的比較（B）。

氧氣消耗和增長率

       將培養0.5、2.5和6.5小時的氧氣水平與當時的光密度進行比較（圖1）。可以觀察到，谷氨酸衣原體和白喉衣原體的生長速率取決于氧氣供應。不同的條件，如不同的振蕩速度和培養量，導致氧氣供應的變化。總之，可用的氧氣越多，生長速度就越高，與已知的數據相匹配。在培養快速生長的細菌（如谷氨酸梭菌）時，監測生長速率和氧氣濃度的相關性非常重要。因為，例如，與以125 rpm搖動的培養物相比，用150 rpm搖動的谷氨酸C. glutamum培養物顯示出更低的氧氣水平，但OD更高，這可能導致氧氣隨著時間的推移而耗盡。像白喉梭菌這樣生長緩慢的細菌的耗氧量非常低，因此它幾乎與氧氣輸入保持平衡。在所有系列實驗中，耗氧量都超過了氧氣輸入，濃度降低。沒有系列達到氧氣限制。

缺氧對GDH的影響

      比較谷氨酸C. glutamum的GDH活性和氧氣消耗沒有顯示出很強的相關性（圖2A）;氧氣的減少導致GDH活性的強弱下降。此外，在氧氣減少與gdh轉錄本量之間沒有顯著相關性。GDH活性的降低在6.5小時內為0.25-0.7U / mg。這些值非常低，可能是由波動或其他調節過程的結果引起的。然而，不能排除氧氣消耗對GDH活性的影響。與谷氨酸衣原體相比，在某些培養條件下，在白喉梭菌的兩個菌株中都可以觀察到GDH活性略有增加（圖2B）。但是測量值真的很低，可能并不重要。兩種白喉菌株培養過程中氧濃度均或多或少降低，GDH活性均增加和降低。白喉衣原體DSM44123的斑點印跡顯示轉錄本增加（25mL / 125rpm除外），這與GDH活性測量無關。這可能表明谷氨酸脫氫酶在轉錄后受到調節。白喉梭菌DSM43988菌株中的斑點印跡和GDH活性測量或多或少匹配，但與白喉梭菌DSM 44123獲得的結果不匹配。由于兩種菌株的結果不同，無法得出關于缺氧對白喉衣原體GDH的影響的明確結論。

結論與觀點

       在測試的培養條件下，在谷氨酸衣原體和白喉衣原體的培養物中，氧濃度對GDH活性沒有一定的影響。由于只能測量非常低的GDH活性值，因此必須使用大量蛋白質進行進一步的測試。谷氨酸梭菌培養的結果并未證實在T. Müller研究中觀察到的預期影響[2]。其他條件可能必須進行測試，例如以更低的搖晃速率或不搖晃進行栽培。由于氧氣的減少有望降低GDH活性，因此相反的方法 - 額外的氧氣輸入 - 可以提供更詳細的見解。這些新方法可能會為GDH活性測量提供更好或更顯著的結果