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       溶解氧（DO）是好氧培養(yǎng)過程中的關鍵參數，由于其溶解度低，氧氣在某些培養(yǎng)條件下會受到限制。本研究開發(fā)了一種預測一次性搖瓶中不同培養(yǎng)條件下氧轉移速率、氧飽和度和最大細胞濃度的新方法。因此，確定體積氣液傳質系數（kLa）從灌裝量、容器尺寸和攪拌速度已經確定。使用SFR搖瓶讀數儀進行氧氣測量。谷氨酸棒狀桿菌的測試表明，使用這種新方法可以實現可靠的培養(yǎng)條件設計，并且可以不受限制地預測最大可能的細胞濃度。

圖1：本研究使用了帶有集成化學光學傳感器（SFS，PreSens）的擋板（左）和非擋板（右）一次性搖瓶。

       搖瓶具有多種優(yōu)點，例如易于操作和高通量，因此廣泛用于研究和工業(yè)。這就是為什么已經在幾項研究中研究了搖瓶中的溶解氧濃度和傳質。然而，這些信息從未用于實驗設計中的初步考慮，或好氧培養(yǎng)中DO的預測，盡管這將具有顯著的優(yōu)勢并防止由于氧氣限制而導致的失敗。在這項研究中，我們開發(fā)了一種可靠預測有氧生長過程中氧飽和度的方法。隨著帶有集成傳感器的一次性培養(yǎng)容器市場不斷增長，我們的實驗集中在這種類型的塑料搖瓶上。我們對 k 進行了系統(tǒng)調查L一個帶和不帶擋板的一次性搖瓶，并使用SFR搖瓶閱讀器實現氧氣監(jiān)測，允許在容器中進行在線監(jiān)測。得到的 k 的數學相關性L然后對谷氨酸梭菌的模型培養(yǎng)進行計算，并事先確定在沒有氧氣限制的情況下可以獲得的最大細胞濃度。

圖2：k的相關性La，30°C下填充體積為10%的擋板搖瓶的燒瓶尺寸和振蕩頻率。

     圖3：以葡萄糖為碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中谷氨酸的生長和耗氧量。在250 mL擋板搖瓶中進行培養(yǎng)，填充體積為30%（A）和10%填充體積（B），轉速為150rpm。該設置中的非氧限制期（灰色區(qū)域）用于確定比生長速率、μ和比攝氧速率 qO2預測值（藍色）和實驗數據（黑色）顯示出好的一致性（B）。

材料與方法

      kLa在不同尺寸（125、250、500 mL）的擋板和非擋板搖瓶中定量，并帶有集成的氧氣和pH傳感器（SFS傳感器燒瓶，PreSens）。在100 mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，在30和37°C的軌道搖床中進行測量，振蕩直徑為50 mm。 使用SFR搖瓶讀數儀（PreSens）實現溶解氧監(jiān)測。搖瓶用緩沖液和Co（NO）平衡3)2（0.1 毫米）。通過添加 200 gL 獲得缺氧-1那2所以3儲備溶液。工作體積（10 - 40 %最大填充量）和振蕩頻率（50、150、250 rpm）各不相同，所有測量一式三份進行。kLa使用Berkley MADONNA（Ver.8.0.1）測定血氧飽和度的20-90%。對于 kL估計值、燒瓶大小、振蕩頻率和 K 之間的經驗相關性La 根據實驗數據匯編。數學擬合要么使用高斯函數，要么使用拋物線函數[1]。C. 谷氨酸ATCC 13032用礦物鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)物在250mL擋板搖瓶（SFS，PreSens）中生長，溫度為30°C，150rpm，填充體積為10%或30%。后者用于確定比生長速率和比攝氧速率。這些實驗確定的生長和攝氧值用于預測谷氨酸梭菌在30 °C，150 rpm下在250 mL搖瓶中以10%填充體積生長期間生物質濃度的增加和DO的降低。

kL搖瓶中的定量

      kLa是通過在充滿緩沖液的擋板和非擋板搖瓶中進行在線氧氣監(jiān)測來確定的。通過添加Na去除氧氣2所以3到系統(tǒng)。當氧化還原反應由Co催化2+完成，燒瓶內的溶解氧增加，可用于測定KLa 對于給定條件。對于所研究的搖瓶，kL值長達350小時-1都下定了。對于無擋板搖瓶，kLA 總體較低，最大 KLa 值為 100 小時-1[1]. 搖晃頻率對氧氣轉移的影響顯著。容器尺寸對k幾乎沒有任何統(tǒng)計學相關影響La的無擋板搖瓶，但對k有一定影響L一個在困惑的燒瓶中。從30°C到37°C的溫升幾乎沒有影響kL一個。然而，對于每個研究的填充體積，在30和37°C下建立了個體相關性。在圖2中，這是在30°C下以10%填充體積的擋板搖瓶所示的。獲得了k的高斯擬合的優(yōu)參數估計L擋板燒瓶和 K 拋物線擬合的值La 非擋板燒瓶的值。

谷氨酸的生長和耗氧量

      圖3 A顯示了谷氨酸梭菌培養(yǎng)物在250 mL搖瓶中的生長和耗氧量，填充量為30%，振蕩頻率為150 rpm。可以觀察到，DO下降得非?？?，并在4小時后變得受限。測定生長和攝氧量至0.38小時-1和 14.2 毫摩爾克-1h-1分別。這些值用于預測細胞生長的時間過程和在另一個迄今為止未經測試的條件下培養(yǎng)谷氨酸梭菌的溶解氧。計算在250 mL擋板搖瓶中進行實驗設置，填充率為10%，振蕩頻率為150 rpm。kLa計算至190小時-1接種物濃度為 0.2 g CDW L-1確定細胞生長的時間過程，如圖3 B（藍色實線）所示;考慮到所有參數，計算了DO（藍色虛線）。在進行實驗和監(jiān)測培養(yǎng)性能時，可以驗證氧氣消耗量確實得到了很好的預測。實驗值和預測值幾乎相同。限制氧氣供應時的預期細胞濃度（4.3 g L-1） 也與實驗實現的 4.6 ± 0.3 g L 的細胞濃度相匹配-1在 20% 的 DO 下。

結論

      本研究結果清楚地表明，該方法可用于預測一次性搖瓶的最佳培養(yǎng)條件和耗氧量。隨著已建立的相關性 kL計算可以從基于緩沖液的系統(tǒng)轉移到標準搖瓶培養(yǎng)。預測特定實驗裝置的氧氣可用性的能力可以顯著改善實驗設計。SFR系統(tǒng)專為一次性搖瓶中的氧氣監(jiān)測而設計，在這項研究中被證明是一個有價值的工具，為這種新方法的開發(fā)及其后續(xù)驗證提供了基礎數據。