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三型副雞禽桿菌對(duì)SPF雞的致病力試驗(yàn)方法
1．1．2 培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基、雞血清雞肉湯和雞
血清雞肉湯瓊脂。參照馮文達(dá)等［9］的方法制備。
1．1．3 試驗(yàn)用雞 120只35日齡 SPF 雞?購(gòu)自北
京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心?在北京所負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)至57
日齡。
1．2 方法
1．2．1 細(xì)菌培養(yǎng) 取凍干卵黃?用普通肉湯稀釋
后?接種雞血清雞肉湯瓊脂?于體積分?jǐn)?shù)為5％ CO2
在37℃培養(yǎng)24h～48h?挑取典型菌落接種雞血清
雞肉湯?在37℃培養(yǎng)10h～12h（B 型）和18 h～
24h（A 型和 C 型）?分裝保存于－80 ℃冰柜的同
時(shí)?進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和純粹性檢驗(yàn)［10］。
1．2．2 試驗(yàn)分組 將120只試驗(yàn)用雞隨機(jī)分成3
組?A 型菌組40只雞?B 型菌組35只雞?C 型菌組
45只雞（表1）。
1．2．3 攻毒 從－80℃取出純粹性檢驗(yàn)合格活菌
計(jì)數(shù)過(guò)的 A、B、C 型菌液?按照保存前計(jì)數(shù)的活菌數(shù)
用半合成培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋?每個(gè)劑量注射5只雞?每
只雞眶下竇內(nèi)注射0．2mL。所含 cfu／0．2mL 如表
1。攻毒后24h 開(kāi)始逐只檢查每只雞的發(fā)病情況?
每天檢查1次?共檢查7d［10］。
1．2．4 細(xì)菌分離 在攻毒后96h?攻毒劑量最小組
（1．5×104 cfu／0．2mL）各隨機(jī)取2只雞?進(jìn)行細(xì)菌
分離［6-8］?粗提 DNA?進(jìn)行 PCR［9?11-12］。
2 結(jié)果
2．1 細(xì)菌培養(yǎng)和活菌計(jì)數(shù)
B 型副雞禽桿菌 BJ-05株在雞血清雞肉湯培養(yǎng)
基 中培養(yǎng)10h 后?菌液渾濁?計(jì)數(shù)結(jié)果為10×
108cfu／mL；A 型副雞禽桿菌 C-Hpg8（CVCC254）在
雞血清雞肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h 后?可見(jiàn)細(xì)菌明顯
生長(zhǎng)?計(jì)數(shù)結(jié)果為0．2×108cfu／mL；668株在雞血清
雞肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h 后?菌液較渾濁?計(jì)數(shù)結(jié)
果為4×108cfu／mL。純檢結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)有其他細(xì)
菌生長(zhǎng)。
2．2 攻毒雞只發(fā)病情況
攻毒后24h～168h?每天逐只檢查雞只的發(fā)病
情況。攻毒后24h?3大組雞只大部分發(fā)病?表現(xiàn)為
眶下竇腫脹?流鼻汁、有少數(shù)雞只面部水腫。攻毒后
48h?除 A 型3．0×104cfu／0．2mL 組和 B 型100×
104cfu／0．2mL 組各有1只雞沒(méi)有發(fā)病外?其余118
只雞均發(fā)病?且大部分雞只呈現(xiàn)明顯的雞傳染性鼻
炎臨床癥狀?眶下竇明顯腫脹?鼻孔周?chē)じ斤暳?
面部水腫明顯?公雞肉垂水腫。攻毒后72 h?A 型
3．0×104cfu／0．2mL 組的5只雞全部發(fā)病?其余基
本與攻毒后48h 相同。攻毒后第4天至第5天?發(fā)
病雞數(shù)和臨床癥狀與攻毒后72h 相同。至第6天?
部分發(fā)病雞只臨床癥狀減輕至消失?攻毒后第7天?
除少數(shù)雞只外?大部分雞只臨床癥狀消失。攻毒后
24h～72h 的詳細(xì)發(fā)病情況見(jiàn)表2。表2中的“＃"
眶下竇腫脹明顯?面部水腫?鼻汁多?有的雞只眼睛
一過(guò)性失明?公雞肉垂水腫。“＋＋＋"表示眶下竇
腫脹較明顯?鼻汁較多；“＋＋"表示眶下竇腫脹?有
鼻汁；“＋"表示用手?jǐn)D壓時(shí)流出鼻汁。
2．3 細(xì)菌分離和 PCR 鑒定
從 A 型、B 型和 C 型各2只雞的眶下竇均分離
到純的副雞禽桿菌?將它們接種普通肉湯和普通瓊
脂?37℃培養(yǎng)96h?均未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。用6個(gè)分離株
的粗提 DNA 進(jìn)行 PCR?結(jié)果6／6陽(yáng)性?與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性
對(duì)照大小（0．5kb）一致（圖1）
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