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抗生素問題

建議和解決方案

增加甘油原液的接種量通常可以獲得更好的質粒產量。

質粒上復制的起源可能固有不同類型的拷貝數。VectorBuilder生產的一些質粒載體是中拷貝或低拷貝型，因此它們的質粒在大腸桿菌中的復制頻率低于高拷貝質粒劑量。為了制備低拷貝質粒，增加用于制備的大腸桿菌培養物的量，以獲得令人滿意的DNA產量。

在大腸桿菌培養中正確使用抗生素對于獲得高質粒產量至關重要。首先，請仔細閱讀甘油儲備管上的標簽，并確保你使用的是與質粒上的抗生素耐藥性基因相對應的抗菌藥物。濫用抗生素會抑制細菌繁殖。其次，一些抗生素，如氨芐青素，在液體培養中降解快。因此，不含質粒的細菌可以繁殖到培養物的很大一部分，導致質粒制劑的產量很低。為了避免這種情況，請在使用前新鮮制備含有氨西林的生長培養基，并確保提供足夠的氨西林。此外，當培養氨西林抗性細菌時，不要讓液體培養物在收獲前很長時間飽和。

EndA'應變

EndA*菌株保留了表達EndA核酸內切酶的能力，這會導致質粒制備產品中的質粒DNA降解。要去除核酸內切酶，請在DNA清除步驟中對質粒制備柱進行額外清洗，或者最好使用EndA菌株進行克隆

微生物污染

如果你需要在沒有抗生素的環境中培養大腸桿菌，請非常小心，以免發生微生物污染。沒有轉化質粒的微生物往往會更快地繁殖，并在細菌培養中占據主導地位，因為質粒復制會消耗細胞分裂的能量。如果污染已經發生，請用75%的乙醇清潔您的工作臺和軌道搖瓶。確保您的培養瓶和移液管端經過良好消毒。你還需要用某些抗生素在瓊脂平板上篩選正確的菌株菌落。

噬菌體污染

噬菌體污染可能導致細菌培養中的細胞裂解。如果發生噬菌體污染，立即扔掉受污染的培養物，丟棄所有用于制備細菌培養物的溶液。用0.05%氫氧化鈉溶液仔細清潔工作臺表面和軌道振蕩器。所有用于細菌繁殖的培養瓶也應通過浸泡法用氫氧化鈉溶液清洗，然后進行高壓滅菌。同樣地具有fhuA突變的大腸桿菌菌株，如VB UitraStable“"化學感受態細胞，優選用于克隆，因為它們對T1噬菌體表現出抗性。

序列對齊

確定兩個序列彼此之間的相似或不同程度是推斷兩個序列之間的結構、功能或進化關系的常用方法。VectorBuilder的序列比對工具不僅可以在DNA或蛋白質水平上直接比較兩個序列，還可以基于翻譯比較兩個DNA序列。

比對提供了整個序列的同一性/相似性百分比的全局視角，以及比較單個核苷酸/氨基酸的重點視角。該工具利用間隙和間隙懲罰來最大限度地提高匹配兩個核苷酸或氨基酸的機會，同時保持數據的完整性。雖然間隙說明了對齊序列中的插入或刪除，但間隙懲罰根據間隙的頻率和長度為對齊分配負分數。

GC內容計算器

DNA模板的GC含量是決定將靶基因成功克隆到所需主鏈中的關鍵因素。具有高GC含量的基因模板通常導致形成自二聚體或二級結構的更高機會，并且需要更高的退火溫度。

該工具允許您確定整個基因序列以及基因內特定區域的GC含量。當輸入DNA或RNA序列時，計算每個堿基類型的數量和百分比。通過調整窗口大小，可以在圖形讀出中可視化序列中較小或較大片段的GC內容。

DNA二級結構

預測由轉錄的DNA形成的二級結構在各種分子生物學技術中很重要，包括siRNA設計和克隆優化。將您的序列粘貼到下面，并接收預測的二級結構的圖形輸出。自由能最小化用于確定堿基對之間的相互作用，突出潛在的莖和環的形成。

RNA二級結構的形成

我們可以根據不同的組織水平來檢查細胞成分的活性。核酸或蛋白質的一級結構分別是核苷酸或氨基酸的基本序列。DNA的主要結構是ATGC序列的列表。基于附近組分之間的相互作用，分子將形成其穩定、低自由能的構象。對于DNA來說，這種二級結構是由兩條互補核苷酸的長鏈相互纏繞形成雙螺旋的結果。這兩個股線及其所得的二級結構具有高水平的穩定性。

然而，一旦被轉錄，RNA就會形成單鏈核苷酸。這種形式不太穩定，核苷酸將尋求與互補核苷酸形成氫鍵：A與U，C與G，G與U。如果沒有像DNA中發現的互補鏈，單個RNA鏈將自身折疊成較低的

圖1。單鏈信使核糖核酸可以自我折疊形成二級結構。

形成的二級結構對RNA的功能有很大影響，無論是編碼還是非編碼，RNA結構在基因功能和調控中都起著重要作用。確定這種結構可以極大地幫助實驗設計和故障排除。我們的二級結構工具提供了RNA鏈低自由能構象的圖形布局。

用戶說明：甘油原液

檢索矢量信息

你的向量有一個未染色的向量lD，打印在甘油儲存管上。您可以通過VectorBullders主頁wectorbullder上的“Reteve Veccior informatlon"鏈接，使用thls lD來檢索矢量圖、矢量序列和矢量組件公告。

存儲

在溫和的溫度下，混合物以E，coll甘油原液（15%甘油）的形式存在。我們強烈建議您在冷凍vlal之前接種Le llquld培養基。在打開管子之前，請先做一次快速旋轉，以從ld中取出reslual llould，避免交叉污染。

arig

甘油原液可放入-80℃中長期保存。我們還建議您單獨制作甘油庫存作為備用。甘油散裝物應僅放置在4’c短期儲存（2周）中。

接種

甘油原液來自單個克隆。你可以用它直接接種LB培養基。然而，在某些情況下，這種方法可能導致液體培養物的DNA yfeld較低。如果你連E，這個問題通常會消失。首先將菌落放在平板上，當菌落全新鮮時，用一個菌落接種液體培養物。如果DNA含量低，請重新轉化，并克隆一個菌落接種新的lB菌株。如果你在后續工作中使用從原始甘油庫中提取的芥子菌集落，那么這個集落相對于母體庫獲得突變的可能性很小。因此，我們建議您在進行進一步的實驗之前，通過測序和限制性內切酶來評估菌落（或幾個菌落）的正確性。

要從未冷凍的糖霜中接種，請將一微濾器的糖霜輕輕地滴入補充有適當抗洗劑的混合液中。如果是從冷凍的甘油原液中接種的，用一個sterle plpette端刮下一小塊冷凍原液，然后小心地將端扔到llquld Le medlum中。你也可以先在LB平板上劃線，然后選擇一個菌落接種LB液體。

一些載體，特別是那些大小較大、序列重復或Gc含量異常的載體，可能有發生重排（如缺失）的趨勢。減少這種可能性的一種方法是在30℃的平板上培養大腸桿菌，并在培養基中代替標準的37℃。

抗生素濃度

打印在甘油儲備管上的載體ls的antblotic restance。請使用LB板或lg培養基中的抗菌劑，濃度如下。

Amplcllin:100μg/ml卡那素:50μg/ml

氯素：34微克/毫升

四環素：5微克/毫升

steptomycin:50ugiml

慶大素：10 pgiml

宿主菌株

請注意甘油儲備管上打印的大腸桿菌宿主菌株信息。大多數載體是在Stbl3宿主中構建的，以確保序列的穩定性。某些應用程序需要使用其他主機。例如，來自pET載體的重組蛋白表達通常需要攜帶T7 RNA聚合酶基因的大腸桿菌宿主，如BL21（DE3），在這種情況下，來自Stbl3宿主的載體需要再轉化到合適的宿主中。

特別通知

VectorBuilder為我們構建的載體提供100%的序列保證。如果您決定進行獨立驗證，強烈建議使用Sanger測序，這是金標準分析。如果出現下一次操作測序（NGS或Nanopore seauencina）所稱的測序錯誤，請在聯系我們獲得售后支持之前仔細檢查buSanger測序的結果。我們最近注意到，在許多情況下，Nanopore測序的錯誤率很高。

疑難解答：質粒DNA產量低

可能的原因

接種物太小

質粒的拷貝數各不相同

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