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 Minerva-biolabs常見問題

蛋白酶K

提供多少毫克蛋白酶？

每小瓶蛋白酶K（目錄號56-0002）含有11 mg酶，約為30U/mg，再懸浮在550µl所含的再水合緩沖液中后，其濃度為20 mg/ml。

你推薦什么樣的培養條件？DNA提取試劑（Venor®GeM樣品制備試劑盒）建議添加蛋白酶K，然后繼續提取（10分鐘，70°C溫育）。這難道不會給酶足夠的時間來工作并可能降解它嗎？

在我們（廣泛）測試的方案中，蛋白酶K的孵育與樣品裂解同時進行（您提到的步驟是在70°C下10分鐘）。其想法是將裂解和蛋白酶K處理結合在一個步驟中，從而使方案盡可能短而有效。我們的數據（和質量控制）表明，這種處理對相對復雜的基質非常有效，表明在短的培養時間（和酶過量！）下可以忽略變性。例如，對于更復雜的基質如組織，我們建議分離提取/裂解步驟和蛋白酶K處理，并在酶的最佳溫度50-56°C下進行蛋白酶K處理。。

我在用Venor®GeM樣品制備試劑盒分離支原體DNA時遇到問題。由于樣品的特殊性質，有時會出現柱堵塞的問題。有時樣品中出現白色薄片（可能是有機來源），離心后留在上清液中，從而堵塞柱。

有時在含有較高蛋白質量（例如疫苗、高血清濃度等）的樣品中觀察到柱堵塞。即使蛋白質可能不是主要成分，它們也可能參與蛋白質和其他成分之間復合物的形成。我們建議根據Venor®GeM樣品制備試劑盒手冊的說明嘗試蛋白酶K處理（70°C培養步驟之前的可選步驟）。

Venor®GeM樣品制備套件

我在用Venor®GeM樣品制備試劑盒分離支原體DNA時遇到問題。由于樣品的特殊性質，有時會出現柱堵塞的問題。有時樣品中出現白色薄片（可能是有機來源），離心后留在上清液中，從而堵塞柱。

有時在含有較高蛋白質量（例如疫苗、高血清濃度等）的樣品中觀察到柱堵塞。即使蛋白質可能不是主要成分，它們也可能參與蛋白質和其他成分之間復合物的形成。我們建議根據Venor®GeM樣品制備試劑盒手冊的說明嘗試蛋白酶K處理（70°C培養步驟之前的可選步驟）。

我們將對EP合規性進行支原體檢測。因此，我們計劃使用Venor®GeM樣品制備試劑盒從細胞上清液中提取支原體DNA。然而，我們需要將一些上清液冷凍在-20oC。你建議什么：從所有樣本中提取DNA并冷凍它們，或者在95oC下處理上清液（穩定步驟）并冷凍它們？我們能把它們冷凍多久？

我們強烈建議在取樣后直接加熱滅活樣品。如果你選擇冷凍，DNase在解凍階段會活躍，降解低拷貝數的支原體DNA。熱滅活后，您可以保存樣本，甚至可以在2-8°C的溫度下保存一周，并在室溫下無限制地處理它們。兩種版本都同樣有用：熱滅活或DNA提取，都是在采樣后立即進行。

對于這兩個版本，您可以將樣品儲存在<-18°C的溫度下至少1年。

Venor®GeM產品線（用于常規PCR）

適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

該試劑盒可檢測到多少種支原體？

基于引物基因組序列比對，我們的試劑盒可以檢測到至少110種屬于軟體動物綱的物種（瘦子、支原體、螺旋體、支原體），其中約165種是文獻中提到的物種。然而，對于許多不太常見的物種，沒有可靠的數據或序列信息。因此，我們不能對這些物種的試劑盒特異性做出任何聲明。

重要的是，我們可以檢測出版物中提到的所有物種作為重要的細胞培養污染物和許多其他污染物。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

內部控制DNA（或內部擴增控制）的功能是什么？

內部控制表示在同一PCR反應管中與靶擴增（支原體）平行發生的第二擴增反應。內部控制擴增子的出現表明條件是PCR允許的（沒有PCR抑制）。因此，內部控制DNA是一種有用的驗證工具，有助于排除假陰性。

在Venor®GeM試劑盒中，內部控制與目標擴增反應的競爭較弱。結果，目標DNA的強擴增（例如強污染）可能導致內部控制擴增失敗。因此，在嚴重污染的樣本或非常有效的PCR擴增的情況下，缺失內部控制是全正常的情況。因此，內部控制的結果與陽性PCR反應無關。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

我想在95°C下冷凍滅活步驟后的上清液，稍后再使用。在什么溫度下，我可以保存這些樣品多長時間？

根據我們的經驗，樣品可以在-20°C下安全儲存至少1年。還可以將滅活上清液在RT下儲存5天或在+2-+8°C下儲存14天。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

我們使用Venor®GeM qEP進行的檢測一直效果良好。然而，這次陽性對照失敗了。補液后，試劑盒按照方案中的建議正確儲存。可能出了什么問題？您有哪些建議可以確保陽性對照的良好表現？

陽性對照作為一個小瓶提供。再水合后，只要您使用無DNase移液管端并在清潔的工作區域工作，該試劑在頻繁的解凍/冷凍循環中是穩定的。

然而，等分補充水分的陽性對照可能會有所幫助。

我們建議將其等分到PCR管中，因為它們通常是干凈的、無DNase的和低結合性的。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

在使用Venor®GeM支原體檢測試劑盒檢測支原體之前，請告訴我在沒有抗生素的情況下培養細胞48小時是否足夠？

如果您的抗生素沒有顯示出對支原體的活性，則可以在沒有任何事先無抗生素培養的情況下進行測試，并將提供有關支原體污染的可靠信息。

在支原體活性抗生素的情況下，我們知道，在無抗生素培養的5天內，大多數支原體種類的微小數量將增長到易于檢測的水平。快速生長的支原體種類可能在48小時后可被檢測到。總之，在沒有此類抗生素的情況下，等待5天培養物生長將給您帶來可靠的結果。請記住，PCR是最敏感的方法。使用其他技術，您可能需要培養和延遲測試更長時間。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

Venor®GeM Classic手冊指出，在培養物中使用霉素和/或霉素不會影響測試。然而，我們使用的是抗生素抗真菌溶液，除了霉素和霉素外，還含有性霉素B。在進行支原體測試之前，我們是否應該在沒有抗生素抗真菌的情況下培養細胞？

性霉素B對支原體沒有活性，不應影響支原體檢測。

補充抗生素抗真菌溶液的培養物可直接使用Venor®GeM Classic試劑盒進行測試。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

我們在媒體上使用了大霉素，我想知道這是否會干擾測試。你指出霉素和霉素不會顯著改變測試的敏感性。大霉素會干擾嗎？

盡管PCR檢測本身不會受到大霉素的影響，但支原體在樣本中生長的能力顯然會受到影響。大霉素對支原體有活性，不幸的是導致耐藥菌株的發展很快。因此，如果可能，我們通常建議在培養1周后，在沒有抗生素添加劑的情況下測試培養物。

適用于所有Venor®GeM支原體檢測試劑盒

我們希望在解凍后直接用Venor®GeM Advance測試細胞（在液氮中冷凍保存），而無需事先培養。這可能嗎？

用我們的PCR檢測方法（任何試劑盒）直接檢測解凍樣品或冷凍樣品通常是不可能的。原因是冷凍介質中通常含有高濃度的FBS和DMSO。這兩種物質都抑制PCR反應。對于這樣的樣品，PCR前DNA提取是必要的。

僅適用于Venor®GeM Classic

我根據方案進行的PCR沒有檢測到任何條帶（既沒有陽性對照，也沒有內部DNA對照）。

試劑都是新鮮重懸的，沒有反復冷凍和解凍。我使用了熱啟動Taq聚合酶，它在其他PCR反應中表現良好。

出了什么問題？

•對于Venor®GeM Classic，我們建議使用熱啟動DNA Taq聚合酶。

•使用在其他PCR設置中表現良好的聚合酶并不一定保證該特定PCR分析的成功。

•套件中提供的緩沖液對于底漆的正常工作至關重要。

•并非所有聚合酶在試劑盒緩沖液和條件下都表現良好。

•全沒有擴增通常表明酶與試劑盒不兼容。

僅適用于Venor®GeM Classic、OneStep和Advance

一些樣本顯示出感興趣基因（支原體）的強條帶，而內部對照沒有條帶。我的樣本是否被污染或PCR運行無效？

只有陰性樣本才需要出現內部控制帶。當你的樣本被支原體嚴重污染時，它的DNA會被成比例地擴增。在這些條件下，由于試劑競爭，內部控制帶逐漸消失。因此，您可以得出結論，您的PCR運行是有效的，不幸的是，您的樣本受到嚴重污染。

僅適用于Venor®GeM Classic、OneStep和Advance

如產品手冊所示，我們使用Venor®GeM Classic和Minerva Biolabs的Taq聚合酶。我們無法檢測到陽性或陰性控制通道中的任何頻帶（內部控制未被放大）。原因可能是什么？

-在PCR反應失敗的可能原因中，我們建議考慮使用中的PCR循環儀可能存在技術問題的可能性。這不是一個遙遠的可能性。為了評估循環儀的性能，我們建議測試具有相同PCR設置的另一個循環儀或具有相同循環儀的另一PCR設置。

-陽性對照DNA的再水合不正確（例如體積）

-PC被正確地再水合，但進行了太多的冷凍/解凍循環，或由于DNase污染而發生DNA降解。

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