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媒體

1. 混合 B27 補充劑 / Neurobasal 培養基 / 0.5 mM 谷氨酰胺后，培養基能穩定多久？

我們在 4 o C 的黑暗中儲存長達 6 個月。

2. 我需要多久補充一次 Neurobasal/B27/谷氨酰胺？

我們每 3 到 4 天更換 1/2 培養基，但這部分取決于細胞密度。參見 INVITROGEN (LTI) FOCUS 16:6。如果細胞密度高于 500/mm 2  ，則每 2 天更換 1/2。

3. 我可以用一些 B27/Neurobasal + 谷氨酰胺（無谷氨酸鹽）稀釋 BrainBits 附帶的 B27/Neurobasal + 谷氨酰胺 + 谷氨酸鹽，比如 1:2 稀釋，細胞仍然生長嗎？

是的，但也不是。請參閱上面引用的 FOCUS 文章。

4. 您通常在培養第 4 天之前向 Neurobasal/B27 添加 25 uM 谷氨酸鹽。谷氨酸的目的是什么？

它幫助海馬神經元發芽并促進活力。

5. 不加谷氨酸有問題嗎？

在 4 DIV 時，您的存活率將降低約 30%。

6. 我需要一些培養基或試劑來維持培養物嗎？

您將需要您選擇的鍍膜玻璃或塑料基板。該訂單包括足夠的培養基來開始培養并維持 4 或 5 天。除此之外，您將需要更多培養基，我們可提供完整的即用型 NbActv1 配方，并通過 Invitrogen 單獨提供。

7. 我應該用抗生素/抗真菌劑補充 B27/Neurobasal 培養基嗎？例如：pen/strep/fungizone 或慶大霉素？

我們通常在不使用抗微生物抗生素和抗真菌劑的情況下進行培養，并取得了良好的效果。這具有三個優點：

首先，當出現污染時，更容易確定污染源。其次，如果您使用抗生素，當您感染時，就更難擺脫。第三，抗生素已被證明可以激活神經元中的癲癇樣爆發活動。然而，我們有時會在慶大霉素 (10 ug/ml) 中開始培養，并在細胞粘附后一小時后將其沖洗干凈。

休眠®

*Hibernate、Neurobasal 和 B27 僅用于研究目的，由 Invitrogen Corporation 制造。Hibernate、Neurobasal 和 B27 是 Invitrogen Corporation 的商標。

1. 我可以使用Hibernate進行木瓜蛋白酶治療嗎？

BrainBits LLC 提供 5 ml 不含 B27 的 Hibernate-Ca，用于在 15 ml 無菌離心管中以最佳方式將 BrainBits 與木瓜蛋白酶解離。添加木瓜蛋白酶 (Worthington) 后，在 37 o C 下溶解10 分鐘。您需要使用 0.2 µm 過濾器對溶液進行消毒。

2. 你是否總是在 Hibernate 中添加 B27 谷氨酰胺，或者它是否仍然在 Hibernate 中保持細胞存活？

幾乎總是。請參閱 Brewer and Price (1996) PM:8856709 的圖 1 在 37 0 C 環境 CO2 中，Neurobasal/B27/gln 中的 LD50 為 24 小時，休眠/B27/gln 中為 >3 天。

3. 我們可以提供不含葡萄糖和丙酮酸的 Hibernate 嗎？

是的，事實上我們有幾個客戶提出了這個要求。因此，我們可以以相同的價格提供不含葡萄糖和丙酮酸的 Hibernate A。您只需要告訴我們您是希望用 NaCl 將滲透壓調整到正常水平還是低于平常水平，以便您可以自行調整。

4.  Hibernate 的其他用途包括：

轉基因小鼠基因分型過程中的大腦儲存

將腦組織運送給合作者

基質

1. 我不經常使用聚-D-賴氨酸。我制作了 5 毫克/毫升的 (100x) 儲備溶液并將其等分到小冷凍管中。我可以將原液冷凍保存多久，并且仍然可以與海馬細胞一起使用？

大概是永遠。不要儲存在聚丙烯管中。聚苯乙烯或 PET 更好。解凍時一定要攪拌均勻。

2. 一些研究人員使用聚乙烯亞胺代替聚賴氨酸。一個比另一個有優勢嗎？

PEI 比聚賴氨酸便宜。我們使用 PEI 并沒有取得多大成功，但 Mark Mattson 在開始在 Neurobasal/10% 血清中培養后一直使用它。報告表明神經元存活率或尖峰率沒有顯著差異。

Soussou WV、Yoon GJ、Brinton RD、Berger TW (2007) 在表面處理的多電極陣列上培養的海馬神經元的神經元網絡形態學和電生理學。IEEE 跨生物醫學工程 54：1309-1320。 電話：17605362

Brewer GJ, Cotman CW (1989) 海馬神經元在低密度限定培養基中的存活和生長：夾心培養技術或低氧的優勢。大腦研究 494:65-74。電話：2765923

3.  BrainBits 神經元越來越多地生長為細胞簇或團塊，而不是孤立的。怎么了？

這意味著細胞與自身的粘附比與基底更緊密。最可能的問題是基材準備不充分。將您的方案與推薦的聚賴氨酸制備和基材涂層進行比較。

4. 關于聚-L-賴氨酸與聚-D-賴氨酸，我假設使用聚-D-賴氨酸，因為如果它分解成賴氨酸，細胞就不能使用d-賴氨酸。有什么道理嗎？

這就是理論。在一些早期研究 (Brain Res. 494:65(1989)) 中，我們發現差異很小。

BRAINBITS® 紙巾

1. 我假設 BrainBits 來自新生動物？

除非另有說明，否則它們來自胚胎第 18 天的大鼠。

2. 皮層培養不包括海馬體，對嗎？

他們可以，但我們準備了沒有丘腦或海馬體的 E18 皮層。我們可以通過特快專遞提供海馬組織或皮質組織。這些“BrainBits"允許在 20 分鐘內為超過 100 萬個海馬神經元或 200 萬個皮質神經元準備細胞，價格為 136 美元。

3. 每個小瓶可以來自皮層和海馬體的神經元數量是多少？

海馬神經元的神經元數量>100 萬或皮質神經元的 200 萬。

4. 海馬神經元什么時候表現出興奮性毒性？

乙酰膽堿在我們所知的任何年齡都沒有毒性。

從 E18 海馬培養 7 天開始，谷氨酸的毒性最大。皮層神經元可能會提前 1 或 2 天。

5. 你知道你從皮質和海馬體中每瓶提供多少個星形膠質細胞嗎？

從海馬開始的星形膠質細胞數量>100萬，皮層>200萬。

6. 動物腦和脊髓組織是根據 NIH 批準的方案獲得的，有哪些保證？

BrainBits 動物協議 #32-08-013 于 11 年 5 月 18 日獲得南伊利諾伊大學醫學院實驗動物護理和使用委員會的批準。

對于 NIH 資助，脊椎動物部分：

保證編號為 A-3209-01

F. 脊椎動物

用于原代培養的海馬、皮層和其他腦和脊髓神經元將從胚胎或出生后早期大鼠或小鼠的腦中獲得。在用氟烷（小鼠）或 IP 五巴比醇（大鼠）麻醉后解剖大腦。

通過從動物中分離神經元，可以研究比整個動物研究更多的實驗變量，從而減少對動物的需求。大鼠和小鼠的大腦是所有動物大腦中研究得好的。

平均住房需求估計為 2 天，足以讓嚙齒動物從運輸創傷中恢復過來。動物將由 AALAC 認可的 SIUSM Laboratory Animal Medicine 進行護理，并在 Teresa Liberati、DVM、Ph.D. 的指導下擁有 10 名員工，并獲得 ACLAM 認證。

用氟烷或麻醉后解剖大腦。因此，這些程序將動物的使用限制在進行具有科學價值的研究中無法避免的范圍內，并最大限度地減少動物的不適、痛苦和疼痛。

用氟烷麻醉后將解剖大腦。將用于大鼠的心臟。小鼠將在麻醉下斷頭臺。這些方法符合美國獸醫協會小組的建議。

7.  BrainBits, LLC 能否從我們胚胎大鼠和小鼠的懷孕母親那里獲得解剖區域？

BrainBits 可以從我們胚胎大鼠或小鼠的懷孕母親那里提供大腦皮質。這是一個建議的協議，供您評估是否要嘗試此操作。請告訴我們您是否以及何時希望 BrainBits 開始向您發送成人皮質以分離內皮細胞。

Wolburg H、Neuhaus J、Kniesel U、Krauss B、Schmid EM、Ocalan M、Farrell C、Risau W (1994) 血腦屏障內皮細胞緊密連接結構的調節。組織培養、第二信使和共培養星形膠質細胞的影響。J Cell Sci 107（第 5 篇）：1347-1357。 電話：1692329

Risau W、Engelhardt B、Wekerle H (1990) 血腦屏障的免疫功能：體外大鼠腦微血管內皮對蛋白質（自身）抗原的不*呈遞。J Cell Biol 110:1757-1766。 電話：7929640

有關從脊髓中分離運動神經元的更多信息 M. Das、JW Rumsey、N. Bhargava、M. Stancescu 和 JJ Hickman。定義的長期體外神經肌肉接頭組織工程模型。生物材料 31 (18):4880-4888, 2010.  PM:20346499

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解散

1. 通過結核菌素注射器上的 18 或 20 號針頭研磨組織是否有問題？

是的。針的邊緣太鋒利了。1 ml 移液管的藍色塑料吸頭更好，但好的是火焰拋光的 9 英寸巴斯德移液管，該吸管之前經過硅烷化處理。確保吸頭開口的直徑至少為 1 毫米。

2. 海馬或皮層細胞的活力是否取決于解離方法？你更喜歡機械解離還是酶解離？

是的，使用木瓜蛋白酶可以獲得更高的活產率（參見 J Neurosci Meth 71:143），但表面蛋白的消化是不可避免的。短期（少于 4 天）這是一個問題。從長遠來看，它可能并不重要。使用火拋光的 9 英寸玻璃移液管獲得更高的生存能力，使用藍色塑料移液管獲得更低的生存能力。對于 E18 組織，我們使用機械來提高速度和簡單性。

3. 您是否使用酶來制備皮質培養物？

為了獲得更高的產量，我們使用 在不含 B27 的H ibernate E-Ca 中稀釋的 2 mg/ml木瓜蛋白酶溶液 。該溶液應在 30 o C 水浴中孵育10 分鐘。不應在此溶液中添加其他化學品，例如 EDTA、巰基乙醇或半胱氨酸-HCl。有關其他信息，請參閱我們的 原代神經元細胞培養方案 。

4. 您為什么推薦不含 B27 的 Hibernate-Ca 以實現與木瓜蛋白酶的最佳解離？

鈣促進粘附。因此，去除鈣會促進神經元的解離。為了提供細胞粘附蛋白作為木瓜蛋白酶的主要底物，B27 被省略，因此 B27 中的蛋白質不會競爭底物。

文化

1. 細胞能存活多少代和多長時間？

如果您每 3-4 天以一半的培養基體積變化來喂養細胞，它們將持續數月。由于它們不會繁殖，因此通過它們是沒有意義的。

2. 它包含多少個星形膠質細胞？

海馬體 BrainBits 中的星形膠質細胞少于 5%。皮質 BrainBits 可能有大約 10% 的星形膠質細胞。如果你在血清中培養，你會得到更多。我們推薦在 B27/Neurobasal (Invitrogen/GIBCO) 中培養。這抑制了沒有 AraC 的神經膠質生長。

3. 我什么時候應該添加 Ara-C 作為星形膠質細胞的有絲分裂抑制劑？

在我們推薦的 Neurobasal/B27 培養基中，您根本不需要添加 Ara-C。該培養基不像血清那樣人為地刺激星形膠質細胞增殖。嘗試一下！

4. 我用 BrainBits 開始的培養物被污染了。開始時它們看起來很好，但現在介質是混濁的黃色，有許多 1-3 um 長的相暗體。

至少有 5 種可能的污染源（假設您的培養箱中的其他培養物沒有受到污染，并且培養箱底部的加濕水是清澈的）：

培養容器本身。通過將新鮮過濾的培養基添加到多個培養容器中進行控制。

粘合劑基材。這并不少見。BrainBits 已準備好無菌底物蓋玻片供您測試。您還可以將新鮮過濾的培養基放在準備好的基質上，以尋找這種污染源。

培養基本身或其添加劑之一（例如，谷氨酰胺）。這并不少見。確保在您的培養基的未涂層孔中進行單獨的測試，并由 BrainBits 提供。

看似隨機或低水平的污染可能來自于朝著開放文化的方向說話甚至呼吸。此外，無菌罩和培養箱之間的空氣不是無菌的，大多數培養容器沒有密封。如果引擎蓋到培養箱的距離很遠，您可以將您的培養物放在已用 70% 乙醇沖洗過的塑料食品容器中。

BrainBits 組織。盡管我們對我們提供的培養基進行了無菌測試，但無法對組織本身進行測試。如果您能提供證據證明您的 BrainBits 組織按時到達并在 4 攝氏度下儲存直至使用，并且上述 4 種可能性已被排除，請致電我們進行一次性更換。通常，我們的經驗是您的樣品是我們本周所有貨物中受到污染的樣品，因此請理解我們需要進行上述測試。

5. 我想知道您是否可以建議我需要接種多少個細胞才能獲得足夠的蛋白質用于幾次蛋白質印跡，即多少個細胞等于 20-50 ug 蛋白質？

根據 Patel 和 Brewer (2003) 的說法，在培養中生長一周的每 18,000 個細胞含有約 6 微克蛋白質。因此，3000 個細胞/微克蛋白質。需要約 50 微克蛋白質的蛋白質印跡提取物將需要約 150,000 個細胞。

冷凍細胞

1. 我嘗試用 1:1 稀釋來自新鮮解凍的冷凍神經元的臺盼藍進行活力染色。所有細胞似乎都染成淡藍色。

這是可以預料的，因為冷凍保護劑會部分滲透膜。非常輕柔地處理這些剛解凍的細胞。在培養幾個小時后或肯定在 15 小時后，與競爭對手的冷凍細胞相比，這些細胞中有更多的細胞將*排除臺盼藍作為生存力的指示。您還可以嘗試使用 5 ug/mL 的紅色熒光染料碘化丙啶對死細胞進行染色。

NBACTIV4®

1. 你能告訴我關于生長條件的改善以及我需要哪些補充劑（例如谷氨酰胺等）來用這種新培養基培養和生長初級 E18 皮質神經元？

您可以像通常使用 Neurobasal/B27 和 0.5 mM Glutamax 的混合物一樣使用新培養基，因為所有這些成分都在新混合物中 + 3 種新成分；膽固醇、雌激素和肌酸。

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預涂培養瓶

1. 你能推薦任何品牌的預涂組織培養瓶或制備用于原代神經元生長的組織培養瓶的方法嗎？

BrainBits 已確定細胞培養塑料或玻璃上的聚賴氨酸涂層在涂層后 2 天內開始失效。我們懷疑一些預涂板的效果令人滿意，但我們的經驗是，其中一些導致原代神經元的粘附和存活不佳。因此，我們建議您涂上自己的基材并在一天內使用它們，如提供的協議中所述。

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祖先

1. 為什么我會立即看到集群形成？

以 30,000/cm 2接種細胞 將導致快速簇形成。如果沒有附著，它們將作為前體留在 Neuropro 中并長成可在 4-7 天內收獲的神經球。4 天后可以開始對巢蛋白或其他抗體進行免疫染色評估。要查看克隆生長，您可以將原始樣品或這些神經球以 50 個細胞/cm2 的組織培養塑料或超低粘附塑料的有限稀釋度鋪在同一培養基中。

為了觀察多能性，在涂有聚-d-賴氨酸（50 微克/毫升水）的基材上以 5 到 15,000 個細胞/cm2 的濃度將神經球平板分離。

2. 我應該接種單個細胞來做神經球檢測嗎？

不，神經球包含一組細胞。您可以將它們固定并作為簇染色或用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶將它們分離，計數以確定產量和/或固定以評估單個細胞。

3. 接種后細胞為單個細胞，但今天已形成簇。一些集群的大小非常大。這是正確的標志嗎？

是的。

4. 我應該觀察神經球的形成來評估細胞的祖細胞階段嗎？

不，至少等待 4 天。

5. 如何區分神經球和簇？

您可以將神經球傳遞到低粘附性塑料或粘附性表面上并觀察差異。只要細胞在低粘附性塑料上，它們就會作為祖細胞留下。

6. 這個階段需要做免疫染色嗎？

至少等待 4 天。

 

 

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