6
在外泌體western鑒定研究領域，NTA技術已被用作外泌體表征手段之一。相較于其他表征方式，NTA技術的樣本處理更簡單，更能保證外泌體原始狀態，檢測速度更快。大致方法是：將收集的外泌體用PBS稀釋至10^6/mL，用1 mL注射器注入納米顆粒跟蹤分析儀(如裝有450 nm激光器的Nanosight NS300顆粒粒度分析儀)；激光光束穿過樣本室外泌體顆粒，通過裝有攝像頭的顯微鏡實現顆粒可視化，捕捉外泌體的布朗運動，利用愛因斯坦方程式根據其運動計算濃度和流體力學直徑。SBI公司新開發的一種排除非外泌體顆粒干擾的試劑盒，還可幫助實現對完整外泌體的NTA分析。除了NTA以外，還有種動態光散射技術（DLS），其原理是：用一束激光打向存放樣品的容器，再在90°這樣一個角度去檢測散射光，得到散射光光強圖譜，通過對圖譜進行時間相關分析；時間分析圖中開始衰減的地方就代表著外泌體的粒徑大小，但是缺少濃度信息；也就是說DLS其實就是通過對不同時間散射光強度的分析，從而得到外泌體相應的粒徑。
掃描電鏡（SEM）的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質相互作用所產生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結構和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術的發展，場發射電子槍的應用得到普及，現代先進的SEM的分辨率已經達到1 nm左右，足夠用來進行外泌體尺寸的測量。透射電鏡（TEM）是把經加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片、感光耦合組件)上顯示出來。
外泌體western鑒定時通常會檢測哪些指標蛋白？ 根據22篇外泌體相關文獻的統計，排在前4位的檢測指標為CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、 CD9和CD81并列第三位（6/22）；接著檢測較多的4個指標為Alix（4/22）、 HSP70(3/22)、 flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外還有一些指標僅在1篇文獻中出現過，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。
針對外泌體的定性檢測至少選擇兩個指標就能滿足文章發表需要了，比如檢測CD63和Tsg101。
外泌體western鑒定定性檢測中有沒有陽性對照？
從發表的文章來看，并沒有一篇文章結果中提到了陽性對照樣品，但是已經被文獻報道的樣品可以作為后人Western blot檢測實驗的陽性對照，通過這樣陽性樣品的檢測來判斷實驗體系是否正常。羅列一下文獻中的陽性對照樣品：脂肪組織巨噬細胞外泌體、神經干細胞外泌體、大鼠皮層神經元外泌體、SCC-9和Cal-27細胞外泌體、MDA-MB-231外泌體、星型膠質細胞外泌體、中性白細胞外泌體等。
外泌體western鑒定主要檢測指標為CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，針對外泌體的定性檢測，至少選擇2-3個指標就能滿足文章發表就可以。大部分文獻中沒有檢測內參，個別文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作為內參進行檢測，外泌體中的Actin、GAPDH和Tubulin的表達豐度相對于正常細胞樣品中的較低，可能會檢測不到任何條帶或者條帶微弱。
外泌體western鑒定操作步驟大致是：
用PBS重懸提取的外泌體，滴于孔徑2 nm的載樣銅網上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網側邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負染5 min，濾紙吸干負染液，室溫晾干，電鏡觀察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯狀結構(也會有200 nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體)，但電鏡對樣品的預處理和制備要求較高，樣品分離方法和樣品性質可能影響電鏡結果的好壞；樣品的準備階段比較復雜，不適合對外泌體進行大量快速的測量；且因外泌體經過了預處理和制備過程，無法準確測量。
掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)或透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)等電子顯微鏡可用于外泌體鑒定。SEM的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質相互作用所產生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結構和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術的發展，場發射電子槍的應用得到普及，現代先進的SEM的分辨率已經達到1 nm左右，足夠用來進行外泌體尺寸的測量。TEM是把經加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片、感光耦合組件)上顯示出來。
以上兩種方法是常用的外泌體的鑒定方法，是展開外泌體功能研究的前提。比如在腫瘤研究中，通過提取鑒定不同細胞系中的外泌體，進而通過PCR以及測序篩選分析RNA，探究外泌體在腫瘤進展或者耐藥中的發生機制。
