慢病毒包裝在基因功能的研究過程中,通過使用慢病毒介導的方法能夠大大提高基因的轉導效率,達到目的基因高效表達的目的。慢病毒主要應用于shRNA、LncRNA、cDNA以及報告基因的研究。
慢病毒包裝具有以下特點:
1)適用于難轉染的細胞,如干細胞、原代細胞等,可很大程度的提高基因轉導效率。
2)慢病毒整合細胞基因組,可進行穩(wěn)轉細胞株的篩選。
3)高純度的慢病毒可用于活體動物模型。
慢病毒表達質粒包含了包裝、感染、穩(wěn)定整合宿主細胞基因組所需的遺傳信息,包裝輔助質粒則提供了所有的轉錄、包裝和重組假病毒所需要的輔助蛋白。為產(chǎn)出高滴度的病毒顆粒,通常將表達質粒和包裝質粒共同轉染至包裝細胞中進行病毒的包裝。包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外培養(yǎng)液中。通過收集含病毒顆粒的上清,進行濃縮和純化可獲得高純度和高滴度的慢病毒。
慢病毒包裝實驗步驟
1、轉染前1天,將293T細胞接種于10 CM培養(yǎng)皿中,加入15 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,置37℃,5%CO2培養(yǎng)至約70-80%融合時,進行細胞轉染。
2、轉染293T細胞
1)將慢病毒表達質粒和包裝質粒加入到Opti-MEM中,混勻。
2)將適量的Lipofectamine™ 2000 (invitrogen)加入到Opti-MEM中,混勻。
3)5分鐘后,將上述兩混合液混勻,室溫靜置20分種后,將混合液加入至培養(yǎng)皿中,前后左右晃動搖勻。置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、6小時后,換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液10mL。
4、轉染48小時后,收集病毒上清,500g離心10分鐘,0.45 μm濾器過濾。
5、濃縮純化后,分裝,-80℃保存。
我們提供已測定好滴度,可以直接進行后續(xù)實驗的慢病毒液、實驗報告。質量保證,慢病毒液可用于感染目的細胞。活性滴度5×108 TU/ml。
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