超全熒光定量PCR應(yīng)用常見(jiàn)問(wèn)題匯總！

時(shí)間：2024/11/11閱讀：72

實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)是什么

20世界90年代由美國(guó)Applied Biosystems公司推出實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time qPCR），其基本原理是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光染料探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程。熒光定量PCR最大的優(yōu)勢(shì)可以對(duì)初始模板進(jìn)行定量，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

常見(jiàn)問(wèn)題羅列

沒(méi)有CT值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果一旦遇到?jīng)]有Ct值情況，就要在第一時(shí)間排查是否有以下問(wèn)題：

（1）循環(huán)數(shù)不夠（但是一般不超過(guò)45循環(huán)，不僅背景值提高，定量也不準(zhǔn)）；

（2）PCR程序設(shè)置不對(duì)，檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集，TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào)，另外熒光采集是否選中；

（3）引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解；

（4）模板量可能降解或上樣量不足（但一般不超過(guò)500ng，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可），對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起；如果發(fā)生模板降解，應(yīng)考慮樣品準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況，建議將模板樣品小量分裝儲(chǔ)備，避免反復(fù)凍融；

（5）引物探針是否合適（尤其是引物跨越內(nèi)含子，以確保擴(kuò)增基因組DNA；上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增）。

CT值過(guò)晚

在相對(duì)定量中，Ct值一般控制在15~25之間比較好，如果在絕對(duì)定量中，對(duì)低拷貝數(shù)的樣品，Ct值會(huì)增大，但是一般不宜超過(guò)40循環(huán)，否則定量不準(zhǔn)確。因此，判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況，需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

（1）擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適，需要進(jìn)行優(yōu)化；引物或探針設(shè)計(jì)不合理，需要重新設(shè)計(jì)；

（2）PCR程序不合適，改用三步法進(jìn)行反應(yīng)，或者優(yōu)化退火/延伸溫度，可以適當(dāng)降低退火溫度；退火/延伸時(shí)間短（可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s）；

（3）MgCl2濃度不合適，增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足；

（4）PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp；

（5）模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

如果遇到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳R²<0.9）的情況，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問(wèn)題：

（1）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或者加樣存在誤差，吸樣不準(zhǔn)，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；

（2）標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃，不要反復(fù)凍融，現(xiàn)配現(xiàn)用；

（3）引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好更穩(wěn)定的引物或探針；

（4）模板中存在抑制物。模板濃度過(guò)高，根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量不超過(guò)500ng，以50~500ng為宜。

陰性對(duì)照擴(kuò)增有信號(hào)

如果陰性對(duì)照擴(kuò)增有信號(hào)，首先排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng)，造成交叉污染：

（1）引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

（2）引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

（3）鎂離子濃度過(guò)高。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒。

（4）模板有基因組的污染。RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。

（5）交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染，建議對(duì)操作環(huán)境進(jìn)行處理，或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。

熔解曲線峰不特異

如果熔解曲線峰不特異，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問(wèn)題：

（1）引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，這是最主要因素；引物濃度不佳，尤其是涉及二聚體存在時(shí)，適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度比例；

（2）離子濃度不合適。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒，不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合，有些情況下可以通過(guò)更換試劑盒改善結(jié)果；

（3）模板有基因組污染。RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。

擴(kuò)增效率低

該情況適用于針對(duì)所有的基因，特別是內(nèi)參基因仍無(wú)法獲得較好的擴(kuò)增信號(hào)時(shí)，應(yīng)考慮如下情況：

（1）反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解；

（2）反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法，適當(dāng)延長(zhǎng)變性退火時(shí)間；

（3）反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時(shí)所引入的，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系，減少抑制物的影響。

擴(kuò)增曲線的異常

如果遇到擴(kuò)增曲線異常，比如“S"型曲線等等情況，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問(wèn)題：

（1）模板的濃度太高或者降解；

（2）熒光染料的降解；

（3）在操作熒光定量PCR時(shí)，帶上新的一次性手套，蓋上避免任何指紋或者字跡等；

（4）液體揮發(fā)。耗材氣密性等問(wèn)題引起液體蒸發(fā)，沒(méi)有很好的聚集在管子里；

（5）氣泡。操作問(wèn)題如移液槍加樣引起的氣泡問(wèn)題。

參考文獻(xiàn)：

Troubleshooting Guide for qPCR and RT qPCR kits （EUROGENTEC）

亚洲中文久久精品无码WW16,亚洲国产精品久久久久爰色欲,人人妻人人澡人人爽欧美一区九九,亚洲码欧美码一区二区三区

超全熒光定量PCR應(yīng)用常見(jiàn)問(wèn)題匯總！

會(huì)員登錄

收藏該商鋪

提示