目錄:和元李記（上海）生物技術有限公司>>生化試劑>>常見抗生素>> AB11L241嘌呤霉素 (Puromycin Dihydrochloride)
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 貨號 | AB11L241 |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產業(yè),制藥 |
嘌呤霉素 (Puromycin Dihydrochloride)是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選通過質粒轉染/轉化、病毒感染等方法能表達pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細胞。Puromycin不僅用于穩(wěn)定細胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細胞株的維持。本產品的10mg/ml包裝經(jīng)過濾除菌，可以直接用于細胞培養(yǎng)。
Puromycin的特點是快速作用于細胞，一般2 d內可以殺死99%的不表達pac基因的細胞。
在革蘭氏陽性菌、動物或昆蟲細胞中，嘌呤霉素通過抑制蛋白質合成而抑制或殺死細胞。其作用機制為嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的類似物，能夠與核糖體的A位點結合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素與A位點結合后，不會參與隨后的任何反應，從而導致蛋白質合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
Pac基因表達嘌呤霉素N-乙酰轉移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，該基因是在Streptomyces alboniger中發(fā)現(xiàn)的。如果表達基因，就會對嘌呤霉素產生抗性，這一特性目前普遍應用于篩選表達pac基因的哺乳動物穩(wěn)定細胞株等。例如，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質粒圖譜上標記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩(wěn)定表達細胞株。嘌呤霉素也可以用來篩選表達pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。
訂購信息
產品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | |
嘌呤霉素 (Puromycin Dihydrochloride) | AB11L241 | 25 mg |
運輸與保存
藍冰運輸。-20℃保存，有效期24個月。
技術參數(shù)
1.CAS：58-58-2
2.分子式：C22H29N7O5•2HCl
3.分子量：544.43
4.純度：>98%
5.結構式：
使用方法
1.推薦工作濃度：
推薦的作用于哺乳動物細胞的嘌呤霉素濃度一般為1-10μg/ml，但最佳工作濃度需要通過劑量反應曲線來確定。
表1. 部分常見哺乳動物細胞的推薦工作濃度表
細胞名稱 | 細胞類型 | 嘌呤霉素濃度 |
A549 | Lung cancer | 1-2μg/ml |
B16 | Mouse melanocytes | 1-2μg/ml |
ES cell | Human embryonic stem cells | 0.5-5μg/ml |
H1299 | Non-small cell lung carcinoma | 1-3μg/ml |
HEK293 | Human embryonic kidney | 0.5-3μg/ml |
HeLa | Human cervical cancer | 1-2μg/ml |
HepG2 | Human hepatocellular carcinoma | 0.5-2μg/ml |
HT1080 | Human fibrosarcoma | 0.5-2μg/ml |
MCF-7 | Human breast cancer | 0.5-2μg/ml |
MDA-MB-231 | Human breast cancer | 0.5-5μg/ml |
MEF | Mouse fibroblasts | 1-5μg/ml |
2.嘌呤霉素劑量反應曲線的確定(以shRNA轉染或者慢病毒感染為例）
嘌呤霉素的有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝及細胞所處細胞周期等因素相關。為了篩選到穩(wěn)定表達的shRNA或感染病毒的細胞株，確定殺死未轉染/感染細胞的zui低濃度嘌呤霉素非常重要。對于初次使用的細胞，一般需要通過實驗來確定適合自身實驗體系的劑量反應曲線(dose-response curve or kill curve)。
（1）第一天：24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接種細胞，接種夠量的孔以便進行后續(xù)的劑量梯度實驗。細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜。
（2）第二天：在培養(yǎng)過夜后的細胞中更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基，該篩選培養(yǎng)基為含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml等)，更換培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
（3）第三天后：由于嘌呤霉素可以快速作用于細胞，一般2d內可以殺死99%的未表達pac基因的細胞，所以在加嘌呤霉素后的1-2 d就可以進行觀察細胞存活率，從而確定有效殺死正常細胞的藥物zui低濃度。如果細胞耐藥性比較強，需要每日觀察，一般4-10 d內即可確定嘌呤霉素的zui低濃度。
3. 哺乳動物穩(wěn)定表達細胞株的篩選
轉染含有pac基因的質粒或者感染含有該基因的病毒后，即可篩選穩(wěn)定表達株。
（1）細胞轉染或感染48 h后，將細胞置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此為處理組。
【注】：當細胞處于分裂活躍期時，抗生素作用zui明顯。細胞過于密集，抗生素產生的效力會明顯下降，所以細胞的密度最好不超過25%。建議同時做一個正常細胞的對照組。轉染或感染48 h后，如果細胞過密也可以消化后重新接種細胞，培養(yǎng)過夜后即可進行嘌呤霉素篩選。
（2）每隔2-3 d，更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。
（3）篩選7 d后，對照組正常細胞應該100%死亡，處理組中存活的細胞為表達pac基因的細胞。然后根據(jù)實驗目的進行多克隆或單克隆細胞的篩選。
【注】：每日進行細胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要24 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2-10 d。
（4）待細胞可以穩(wěn)定生長后，嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續(xù)的培養(yǎng)。在得到穩(wěn)定表達細胞株后，一般建議嘌呤霉素也須持續(xù)加入，并2-3 d更換含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液。
注意事項
1.本產品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。
2.用于細胞實驗，溶解后，須用一次性針頭濾器過濾除菌。
3.抗生素不穩(wěn)定，請在有效期內盡快使用。
4.以上數(shù)據(jù)均來自公開文獻，和元李記暫未本產品進行獨立驗證，僅供參考。
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