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上海萊睿科學儀器有限公司
主營產品： 安捷倫液相色譜儀,氣相色譜儀,尼高力紅外光譜儀,IKA磁力攪拌器,TOMY高壓滅菌鍋 |
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2017-5-2 閱讀(2682)
材料與方法
實驗試劑與儀器
黑曲霉屬脂肪酶(S-7449 from Aspergillus niger,三丁酸甘油酯; 考馬斯亮藍G-250; 奧利司他; 聚乙烯醇(簡稱PVA, 聚合度1750); 其他試劑為國產分析純；實驗用水為雙蒸水。
超級恒溫水浴鍋;高速離心機;精密PH計;超聲儀;安捷倫氣相色譜儀帶FID檢測。
色譜條件Supecl-NUKOLTMFFAP毛細管柱(固定相為對苯二甲酸改性的聚乙二醇；30 m × 0.53 mm × 0.5 μm)，柱溫100 °C，保持5 min，以20 °C·min−1的速率升溫至180 °C后，保持6 min。分流。進樣口溫度250 °C，檢測器溫度250 °C，載氣（氮氣）流速10 mL·min−1，氫氣流速30 mL·min−1，空氣流速300 mL·min−1，尾吹30 mL·min−1。進樣量1 μL。
溶液的配制
正丁酸標準溶液：精密稱取正丁酸適量，用乙腈稀釋，配制成8個不同濃度的正丁酸標準溶液。
脂肪酶溶液：精密稱取適量酶粉，溶于pH 7.5的0.1 mol·L−1Tris-HCl緩沖液10 mL中，超聲20 min，離心10 min（3 500 r·min−1）。取上清液作為酶反應液。脂肪酶蛋白濃度以考馬斯亮藍法測定。
三丁酸甘油酯乳化液：精密量取三丁酸甘油酯1 mL，以2%PVA溶液定容至10 mL，超聲20 min。
脂肪酶活力的檢測
測定原理：三丁酸甘油酯在脂肪酶的作用下水解成甘油和正丁酸。產物正丁酸可以通過氣相色譜進行定量分析。由此，可以計算出脂肪酶的活力單位。
脂肪酶活性測定：反應總體積為500 μL。空白組組成為：底物乳化液100 μL，pH 7.5的Tris-HCl緩沖液400 μL。實驗組組成為：底物乳化液100 μL, pH 7.5的Tris-HCl緩沖液200 μL，酶液200 μL。在32 °C水浴反應5 min后，加入乙腈800 μL終止反應, 振蕩10 s，離心10 min（10 000 r·min−1），取上清液進樣分析。
脂肪酶活力單位定義：在pH為7.5，溫度為32 °C條件下，每分鐘催化三丁酸甘油酯水解生成1 μmol正丁酸的量，定義為一個酶活力單位。計算公式為：
X為脂肪酶活力(U·mg−1); B為實驗組產生的正丁酸的量(μmol); A為空白組產生的正丁酸的量(μmol); C為體系中所含酶量(mg); t為反應時間(min)。
脂肪酶抑制活性的檢測
原理：脂肪酶抑制劑（奧利司他）能抑制脂肪酶活性，通過比較有無抑制劑加入情況下生成的正丁酸量的差異，來評價脂肪酶抑制劑對脂肪酶活性的抑制程度。
測定方法：按上述方法，在反應液中加入奧利司他甲醇溶液100 μL 后，測定生成的正丁酸的量。
結果與討論
1正丁酸標準曲線
正丁酸在0.11～11.35 mmol·L−1內，峰面積(y) 與濃度(x) 的回歸方程為: y = 45 464x −3 115.2, r = 0.996 8。結果表明正丁酸的濃度與峰面積線性關系良好，因此可用氣相色譜外標法對正丁酸進行定量檢測。
2zui適pH值和反應溫度的選擇
脂肪酶在堿性條件下具有較高的活力，*pH值為7.48。如圖所示。
不同來源的脂肪酶具有不同的zui適反應溫度。通常，豬胰脂肪酶的zui適反應溫度為37 °C左右；黑曲霉屬脂肪酶在25～35 °C具有較高的酶活，本文所測zui適反應溫度為(31.6 ± 0.5) °C，如圖所示。
3反應時間和方法專屬性
正丁酸在5 min左右就能被檢測到，且峰形良好, 如圖3所示。脂肪酶水解樣品中，正丁酸與其他雜質能達到很好的分離效果。
4終止劑的選擇
每種終止劑平行測定3次，表中所列差值范圍為平行樣的標準偏差范圍。結果下表。本文選用乙腈作為反應終止劑。
在未經反應的實驗組溶液中分別加入濃度為0.22, 1.14和5.68 mmol·L−1的正丁酸標準溶液, 通過檢測并計算正丁酸的平均回收率來考察本方法的準確性和精密性。平均回收率分別為90.3%, 104.6%和89.4%; RSD值分別為3.01%, 4.50%和6.64% (n = 3)。
6脂肪酶米氏常數的測定
該實驗方法下米氏常數Km值為0.25 mmol·mL−1。結果如圖4所示。
7奧利司他溶劑的選擇及其IC50值的測定
為了進一步驗證方法的可靠性，在反應體系中加入奧利司他溶液，測定其對脂肪酶的抑制作用。奧利司他極性很小，通常只溶于氯fang、甲醇、二甲亞砜(DMSO) 和四氫呋喃(THF) 等有機溶劑。由于氯fang與緩沖溶液不互溶，DMSO對正丁酸峰產生干擾, 本文僅考察了甲醇和THF對酶的抑制情況。體系中16.7% (加入量100 μL) 的甲醇或THF對酶的抑制率分別為47.9%和89.4%。所以本文選擇抑制活性較小的甲醇作為奧利司他的溶劑。以甲醇空白液為對照(抑制率為0)，計算出IC50值為0.048 5 mg·mL−1，
結論
以氣相色譜檢測脂肪酶活力的方法克服了滴定法重現性差和準確性低的缺點，具有反應體積小，反應時間短，檢測速度快等優點，適合于脂肪酶活力的測定及其抑制劑的篩選。
