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免疫熒光

細(xì)胞免疫熒光染色
免疫熒光：1.材料準(zhǔn)備
1)蓋玻片.載玻片
蓋玻片 水洗 浸泡于75％的乙醇溶液
超聲波 泡酸
載玻片 水洗 無水乙醇浸泡 烘干
2）試劑
a.固定液: 4％甲醛， 4％多聚甲醛（PBS，72度溶解）
b.透膜液：0.2％或0.3％triton X-100, 甲醇＋丙酮（V：V＝1：1）
c.封閉液：5％BSA
以上試劑除甲醇＋丙酮外均用PBS配制
d.一抗：Rabit-anti-HA（1:500） ,Mouse-anti-myc（ 1:500）,
Mouse-anti-flag（1:1500),
e.二抗：
Goat-anti-Rabbit FITC(1:500) , Goat-anti-Rabbit-Mouse Texas(1:500）
一抗二抗 均用封閉液稀釋
f. Hoechst 5ug/ml PBS稀釋
g. 90％甘油溶于PBS
h . 指甲油
2. 蓋玻片處理
在細(xì)胞培養(yǎng)之前為了讓某些細(xì)胞（例如293，293T）的貼壁性能提高需對(duì)蓋玻片進(jìn)行處理，常用的處理方法有：
A：凝膠（gelatin）處理：
1.配制2%的凝膠水溶液，高壓滅菌（同時(shí)也有助于凝膠的溶解）
2.將適量蓋玻片（一般不超過40片）放入10cm的細(xì)胞培養(yǎng)盤
3.加入10ml 2%的凝膠溶液放在脫色搖床上，在室溫下shake1小時(shí)。
4.將200ul的25％的異戊二醛加到10ml的新配制的1xPBS
5.吸去凝膠溶液，加入新配制的異戊二醛溶液，室溫下?lián)u15分鐘。
6.用PBS洗5次，每次5分鐘。
7.將蓋玻片放在30mm盤或者是六空板，UV照射1小時(shí)，備用。
B：多聚賴氨酸處理
1.將洗干靜的蓋玻片放在40 μg/ml多聚賴氨酸處理溶液中，室溫下浸泡大約1小時(shí)
2.自來水沖洗1小時(shí)，然后用蒸餾水浸泡3次，每次5分鐘。
3 UV照射3小時(shí)，備用。
3.細(xì)胞培養(yǎng)
根據(jù)細(xì)胞的不同生長速度而調(diào)節(jié)分細(xì)胞時(shí)的密度，一般說來，在細(xì)胞固定前其密度達(dá)到1X106
為宜1X106
4.轉(zhuǎn)染
為了檢測(cè)某種蛋白分子的細(xì)胞內(nèi)定位或者觀察兩種蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)的共定位，常常將某基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，常用的有PEI，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等。
5.染色
1).轉(zhuǎn)染24hr后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗一次
2).固定： 4％甲醛或 4％多聚甲醛， 20min， PBS洗二次
3).透膜：a. 0.2％或0.3％triton X-100, RT，10min ,PBS洗二次
b.甲醇＋丙酮（V：V＝1：1）, -20 °, 20min, PBS洗三次
4).封閉：封閉液800ul， RT，60min （時(shí)間可以長些，4° ）
5).一抗：100ul ,RT ，1hr 或者37 °，45min，PBS洗5次，5min/time
6).二抗：100ul ,RT ，1hr 或者37 °，45min，PBS洗2次，5min/time
7).染核：Hoechst，200ul,10min, PBS洗4次，5min/time
8).封片：9ul 90％甘油. 不要留有氣泡。
6. 熒光顯微鏡觀察