鈣化性主動脈瓣疾病（CAVD）已成為世界范圍內是最常見的瓣膜性心臟病之一。在過去的幾十年中，一系列臨床、體內和體外研究都指出炎癥是CAVD早期的主要機制。在瓣膜內皮細胞（VEC）中，已知TNF-α可誘導炎癥和氧化應激以及內皮向間充質轉化，IL-6也促進了這一過程。免疫細胞因子I型和II型干擾素（IFNs）已被證明可促進瓣膜間質細胞（VIC）的炎癥和鈣化。然而，IFNs在VEC中的影響仍然未知。I型和II型IFNs、下游Janus 激酶（JAK）和信號轉導器（如轉錄激活因子）在調節免疫和炎癥反應中起關鍵作用。在主動脈瓣中，一份報告顯示，IFN-γ在患病人瓣膜的鈣化區域表達。

主動脈瓣內皮持續暴露于血流動力學力，對于維持瓣膜完整性和穩態至關重要。大多數指向VEC在CAVD中具有保護作用的證據都來自體外和離體模型。值得注意的是，鈣化主要發生在主動脈瓣的纖維層，這一過程可能由主動脈側（aVEC）或心室側（vVEC）內皮細胞之間的特異性差異調節。主動脈瓣兩側出現顯著的血流動力學差異。主動脈表面暴露于振蕩性低剪切流，心室側暴露于層流高剪切流，這被認為會促進血管系統內抗動脈粥樣硬化區域的存在。

在西班牙巴利亞多利德大學和西班牙國家研究委員會、倫敦帝國理工學院國家心肺研究所等研究團隊的一項實驗項目中，曾探討了IFNs對人類VEC的影響，重點關注炎癥、免疫細胞粘附和細胞遷移，并將其與典型的促炎細胞因子TNF-α的作用進行比較。此外，還分析了潛在的兩側特異性差異和流動模式的影響。研究結果可以為細胞因子及其在VEC中的相互作用提供新的見解，可能與理解CAVD的發生有關。相關研究成果發表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“Interferons Are Pro-Inflammatory Cytokines in Sheared-Stressed Human Aortic Valve Endothelial Cells"。

首先，研究人員試圖調查人VEC是否對I型和II型IFNs有反應，利用由瓣膜主動脈側和心室側細胞組成的混合VEC群，在靜態條件下與重組I型和II型IFNs（分別為IFN-α和IFN-γ）一起孵育。數據顯示，IFN-α和IFN-γ均促進VEC中酪氨酸701殘基處的STAT1磷酸化。為了闡明IFN誘導的表型，分析了與內皮功能相關的基因的表達，即血管內皮生長因子A（VEGFA）和內皮型一氧化氮合酶（NOS3），分析顯示，IFNs不影響VEGFA和NOS3的表達。相比之下，TNF-α誘導VEGFA上調，說明兩種細胞因子在人VEC中具有不同效應。

IFNs被認為是人VIC中促炎性細胞因子，因此研究了IFNs 的炎癥潛能。結果表明，在靜態條件下的VEC中，IFN-α和IFN-γ促進了炎癥主轉錄因子NF-κB 的激活。IFNs一致地上調下游基因的表達，即細胞間細胞粘附分子（ICAM）-1和血管細胞粘附分子（VCAM）-1。TNF-α是zui有xiao的促炎細胞因子。此外，qPCR分析顯示，IFN-α和IFN-γ增加了IL6基因的表達，然而，只有 IFN-α 增加了 IL8 表達，這表明 VEC 響應中的 IFN 型特異性。總之，數據顯示，I型和II型IFN在從人類非鈣化瓣膜分離的VEC中是促炎細胞因子。

接下來，研究了從瓣膜主動脈側或心室側特異性分離的VEC中IFN-γ對缺氧誘導因子（HIF）-1α表達的潛在特異性反應。為了模擬不同的剪切模式，在軌道振動臺渦流系統中培養并激活細胞，該系統在邊緣（單軸）和中心（多向）之間產生剪切應力量的差異。

分析顯示，TNF-α，而非IFN-γ，在處理24小時后促進aVEC中的HIF-1α的穩定，然而，IFN-γ和TNF-α之間的相互作用對于促進vVEC中的HIF-1α穩定是必要的（圖1 A）。HIF-1α調節參與代謝和血管生成的幾個下游基因的表達，如VEGF-A。aVEC活化后，沒有細胞因子能促進VEGF-A的分泌（圖1 B）。

此外，TNF-α，而非IFN-γ，觸發了aVEC和vVEC中的NOS3蛋白下調（圖1 C），表明這些細胞因子誘導的內皮表型存在差異。總之，數據顯示，在剪切應力條件下，IFN-γ和TNF-α對兩側特異性VEC中HIF-1α和NOS3表達有明顯影響。

圖1   TNF-α而不是IFN-γ促進了兩側特異性VEC中的HIF-1α的免疫誘導以及NOS3蛋白下調。（A-C）aVEC和vVEC暴露于剪切48小時，然后用zhi定的配體處理24小時。 

內皮細胞遷移在血管生成中至關重要，并受HIF-1α調節。因此，分析了細胞因子在aVEC和vVEC的多軸剪切流下修復傷口愈合的能力。劃痕測定顯示，TNF-α和缺氧誘導劑氯化鈷2（CoCl2）在 aVEC 中促進傷口wan全愈合，但在 vVEC 中沒有。相反，IFN-γ顯著減少vVEC中的傷口愈合，并顯示出減少aVEC遷移的趨勢，并且還抑制了TNF-α介導的細胞遷移。總的來說，數據證明了瓣膜側和細胞因子在細胞遷移方面的差異。

接下來，分析了IFN-γ在兩側特異性VEC中誘導的炎癥表型。ELISA分析顯示，IFN-γ和TNF-α誘導IL-6分泌，其中TNF-α是zui有xiao的細胞因子，而兩種細胞因子合作增強了這種效果。此外，IFN-γ顯著促進了IP-10/CXCL10的分泌，而TNF-α誘導的分泌在aVEC中的分泌量顯著高于vVEC。

對于粘附分子表達，蛋白質印跡表明，IFN-γ顯著誘導ICAM-1和VCAM-1，盡管程度低于TNF-α，并且aVEC和vVEC之間沒有顯著差異（圖2）。需要注意的是，HIF-1α的化學穩定不影響粘附分子表達，這表明該轉錄因子不參與這些炎癥反應（圖2）。總的來說，數據表明IFN-γ促進VEC的促炎表型，表現出與TNF-α的差異。

圖2   IFN-γ和TNF-α促進aVEC和vVEC中的粘附分子表達。將細胞暴露于剪切48小時，并用zhi定的配體處理24小時，并通過蛋白質印跡分析全細胞提取物的ICAM-1和VCAM-1表達。

免疫細胞浸潤是CAVD最早的事件之一。為了闡明這一過程，實驗最后研究了多軸和單軸流動模式對單核細胞粘附到瓣膜內皮細胞的影響。結果表明，IFN-γ 和 TNF-α 增加了多軸和單軸剪切流下單核細胞對aVEC 的粘附（圖3 A-D）。值得注意的是，THP-1粘附的數量和 THP-1/VEC 比值顯示，與孔的邊緣（單軸）相比，中心（多軸）的粘附量明顯更高（圖3 D）。此外，TNF-α與IFN-γ聯合進一步增強促粘附效應（圖3 D）。總之，數據證明了IFN-γ和TNF-α對單核細胞粘附到aVEC單層的流動特異性影響。

圖3    IFN-γ和TNF-α在多軸剪切流條件下更高程度地促進單核細胞對aVEC單層的粘附

圖4    描述IFN在剪切應力位點特異性VEC中影響的模式

（A）在靜態條件下的混合VEC中，IFN促進以誘導STAT1和NF-κB路線以及隨后的炎癥分子為特征的促炎表型。（B）兩側特異性VEC暴露于剪切流，細胞因子（IFN-γ，TNF-α）會促進炎癥。此外，在多軸剪切流條件下，aVEC更容易發生細胞因子介導的單核細胞粘附。最后，TNF-α和HIF-1α 的化學誘導劑（CoCl2）促進了遷移效應，而IFN-γ降低了TNF-α介導效應。總之，數據揭示了細胞因子和流動模式之間的差異。

總的來說，該研究數據揭示了關于IFNs在人VEC中的炎癥作用的新發現，顯示了TNF-α在遷移和NOS3下調方面的差異，還描述了多軸剪切流條件可能會增加免疫細胞對炎癥瓣膜內皮細胞的粘附。這項研究提供了新的發現，這些發現可能與了解疾病的初始炎癥階段有關，并支持將JAK/STAT通路作為CAVD潛在相關途徑的研究。

參考文獻：Parra-Izquierdo I, Sánchez-Bayuela T, López J, Gómez C, Pérez-Riesgo E, San Román JA, Sánchez Crespo M, Yacoub M, Chester AH, García-Rodríguez C. Interferons Are Pro-Inflammatory Cytokines in Sheared-Stressed Human Aortic Valve Endothelial Cells. Int J Mol Sci. 2021 Sep 30;22(19):10605. doi: 10.3390/ijms221910605. PMID: 34638942; PMCID: PMC8508640.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34638942/

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