骨髓間充質干/基質細胞（MSCs）存在于骨髓中，具有高度的自我復制能力和多向分化潛能，可分化成多種細胞，是再生醫學中臨床上使用最多的干細胞之一。然而，間充質干細胞在骨髓中僅有少量存在（約為兩百萬分之一），為了獲得所需數量的細胞，必須培養MSCs才能擴增，但這會導致干細胞特性（干性）顯著降低，例如分化多能性和增殖能力。目前，旨在闡明MSC自我更新和干性維持的分子機制的研究正在取得進展。然而，在維持干細胞干性的同時建立培養MSCs的方法仍然具有挑戰性。如果能夠建立這樣的方法，MSCs在臨床應用中的使用將大大擴展。

骨髓中的間充質細胞提供了一個稱為生態位（niche）的微環境，其中造血干細胞/祖細胞（HSCs）的干性由各種因素維持，例如C-X-C基序趨化因子配體12（CXCL12）和透明質酸。這些間充質細胞被認為對應于巢蛋白陽性細胞、N-鈣黏蛋白陽性細胞、CD31陽性細胞和表達CXCL12的網狀細胞。Zhong所zhou知，促血小板生成素（TPO）對巨核細胞生成至關重要，有助于HSCs的維持和擴增。缺少TPO或其受體（c-Mpl）的小鼠不僅顯示巨核生成受損，而且HSC數量和功能降低。最近的報道表明，需要TPO來維持骨髓內HSCs的靜息狀態。

細胞間相互作用在各個發育階段和組織穩態維持中起著關鍵作用。在個體發育和器官發展過程中，不同胚層的細胞之間經常觀察到這種相互作用。研究表明，從HSCs到MSCs的干性信號也存在，作為間充質譜系HSCs的干性信號的對應物。因此，東京大學醫學部口腔頜面外科、東京醫科齒科大學齒學研究科以及德克薩斯大學休斯頓健康科學中心的聯合研究人員假設TPO / c-Mpl信號對于從HSCs到間充質細胞的干性信號也很重要，在一項研究中，利用c-Mpl缺失小鼠來檢測HSCs和MSCs中c-Mpl缺失對其增殖能力和干性維持的影響。相關研究成果發表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“Hematopoietic-Mesenchymal Signals Regulate the Properties of Mesenchymal Stem Cells"。

首先，為了驗證造血-間充質細胞相互作用的存在，將表達EGFP的小鼠骨髓來源的間充質細胞（BM細胞）與人急性骨髓性白血病細胞（KG-1細胞系）共培養，然后計算了一段時間內共培養的細胞數量，發現與KG-1細胞的直接共培養刺激了BM細胞的增殖。相比之下，間接共培養對BM細胞增殖影響不大（圖1 A、B）。KG-1細胞增殖不受與BM細胞共培養的影響（圖1 A、B）。

已知MSCs 在體外培養過程中會經歷加速分化。有和沒有與KG-1細胞共培養的細胞之間的形態無顯著差異（圖1 C）。因此，檢測了血小板衍生生長因子受體（PDGFR）α 和干細胞抗原-1（Sca-1）以及MSC特異性標志物在小鼠中的表達。在與KG-1細胞共培養的細胞（BM細胞+ KG-1細胞）中表達PDGFR-α和Sca-1的細胞比例明顯高于未與KG-1細胞共培養的細胞（BM細胞）（圖1 D）。然后進一步研究了共培養對多譜系分化能力的影響。共培養后誘導軟骨細胞分化，在BM細胞中觀察到Sox9的表達（圖1 E）。這些數據表明，BM細胞與KG-1細胞的共培養可促進其增殖和軟骨細胞分化能力。

圖1   間充質-造血細胞相互作用促進BM細胞增殖。

接下來，為了再次確認造血-間充質細胞相互作用對MSCs的影響，實驗評估了與HSCs共培養過程中MSC特性的變化。結果表明，與HSCs直接共培養促進了MSCs的增殖，而間接共培養無影響。有趣的是，造血細胞顯示出細胞數量的顯著增加，特別是在在間接共培養過程中。然后檢測了它們在共培養增殖的間充質和造血細胞中的比例，觀察到從第0天開始，MSC標記陽性細胞顯示出隨時間而略有增加的趨勢，而HSCs細胞的數量在共培養后立即大幅下降。此外，還評估了MSCs在共培養后的多能性，觀察到在誘導成骨、成脂和成軟骨分化后，各分化標志物的表達上調。這些數據表明，直接間充質-造血細胞相互作用促進了MSCs的干性，而且從HSCs 轉變到MSCs 時存在一個信號。

為了更詳細地研究HSC信號對MSCs的影響，使用微陣列分析檢查了與HSCs共培養后MSCs的基因表達譜。在MSC和HSC共培養組和僅MSC組（對照）中，觀察到轉錄因子的上調。這些MSCs表達SRCIN1、BNC1和PCK1。SRCIN1調節細胞擴增和遷移；BNC1參與卵母細胞成熟的正向調節，也可能在胚胎的早期發育中發揮作用；PCK1通過其蛋白激酶活性調節脂肪生成。基于此，HSCs可能具有維持MSCs的未分化特性和代謝的潛力。此外，還分析了差異表達基因（DEGs）。然而，在對照組與共培養組之間未觀察到DEGs。然后進行了基因集富集分析（GSEA）以檢測信號趨勢。對C2_curated基因集（標志性基因集）進行分析的結果發現，以下富集的基因存在顯著差異：“I型膠原蛋白合成"、“脂肪生成"、“Wnt blocked by Frizzled"和“H3K27me3"，這些基因在共培養的MSCs中受到抑制。GSEA分析結果支持HSC信號可能會影響MSC特性。

據報道，MPL信號是維持HSCs未分化狀態的直接機制之一。為了確定c-Mpl缺失小鼠的干性信號對MSCs的影響，分析了c-Mpl敲除小鼠的細胞。首先，從c-MPL缺失和野生型小鼠中收獲MSCs，以檢查HSC缺失對MSCs的影響。在CFU-F測定中，c-Mpl缺失小鼠來源的MSCs顯示出與野生型小鼠細胞相當的集落形成能力（圖2 A、B）。當收獲的細胞傳代培養時，兩種細胞類型之間的增殖能力或PDGFR-α/Sca-1陽性細胞的比例沒有顯著差異（圖2 C、D）。此外，通過實時RT-PCR檢測MSCs的多能性，驚訝的是，在c-Mpl缺失小鼠來源的MSCs中觀察到軟骨標志物表達的顯著增加。雖然兩組之間成骨標志物和成脂標志物的表達沒有顯著差異，但這些標志物在c-Mpl缺失小鼠的MSCs中往往更高（圖2 E-G）。這些結果表明，c-Mpl缺失的MSCs在體外表現出增強的分化活性。

圖2  c-MPL缺失的MSCs具有正常的增殖和分化潛力。

然后，在體內評估了來自c-Mpl缺失和野生型小鼠的MSCs的成骨特性，顯示c-Mpl-WT和c-缺失的MSCs在移植后早期出現骨形成。然而，c-Mpl缺失小鼠來源的MSCs比野生型MSCs更早地促進骨形成。蘇木精和伊紅染色顯示第 2 周和 4 周均存在移植物。這說明，c-MPL 基因缺失影響異位骨的維持。

最后，為了研究HSCs的干性與HSCs到MSCs的干性信號之間的關系，將野生型MSCs與野生型小鼠HSCs或c-Mpl缺失小鼠的HSCs共培養。與HSCs共培養（c-Mpl野生型（WT）和c-Mpl敲除（KO））共培養后，MSCs的集落形成能力不受c-Mpl缺失的影響（圖3 A）。然而，與c-Mpl缺失小鼠的HSCs共培養未能刺激MSC增殖（圖3 B）。在未共培養的MSCs中，盡管Sca-1和PDGFR-α陽性率在培養后立即下降，但從第0天到第6天幾乎保持不變（圖3 C）。在與野生型HSCs共培養的野生型MSCs中，盡管Sca-1和PDGFR-α的陽性率從-2天到第0天暫時下降，但在第3天恢復并維持在40%左右（圖3 C）。然后，檢測了與c-Mpl缺失或野生型小鼠HSCs共培養的MSCs的多能性。與c-Mpl缺失小鼠的HSCs共培養的MSCs中成脂標志物水平顯著更高，軟骨細胞分化標志物的水平也更高。兩組成骨標志物表達相似（圖3 D）。因此，可以認為在HSCs中，c-Mpl會影響MSCs增殖能力的維持。

圖3   HSCs中的c-Mpl調節MSC的特性。

綜上所述，這項研究驗證了從造血細胞到間充質細胞的干性信號。此外，這表明HSCs的干性對于維持MSCs的干性很重要。該研究結果可能有助于建立一種利用干性信號來擴增具有高干性的間充質干細胞的培養方法，從而為再生醫學的發展做出貢獻。

參考文獻：Kanazawa S, Okada H, Riu D, Mabuchi Y, Akazawa C, Iwata J, Hoshi K, Hikita A. Hematopoietic-Mesenchymal Signals Regulate the Properties of Mesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2022 Jul 26;23(15):8238. doi: 10.3390/ijms23158238. PMID: 35897814; PMCID: PMC9330127.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35897814/

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