牙周膜細(xì)胞（PDL）細(xì)胞是牙周再生治療的有前途的工具。獲得足夠數(shù)量的PDL細(xì)胞對于PDL再生至關(guān)重要。PDL細(xì)胞的再生潛力已經(jīng)在大型動(dòng)物模型中進(jìn)行了研究，并報(bào)道了其臨床結(jié)果。然而，由于它們對組織資源和增殖能力的限制，開發(fā)有效的方法來擴(kuò)增PDL細(xì)胞以進(jìn)行牙周再生至關(guān)重要。

PDL位于牙槽骨和牙骨質(zhì)之間，它持續(xù)感知機(jī)械力，例如正畸牙齒移動(dòng)（OTM）或咀嚼過程中的拉伸應(yīng)力、壓應(yīng)力和剪切應(yīng)力。PDL細(xì)胞感知并響應(yīng)機(jī)械應(yīng)力，這對于組織穩(wěn)態(tài)和重塑至關(guān)重要。

YAP是Hippo通路的共轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、遷移和分化中起重要作用。此外，YAP還具有機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。有研究報(bào)道，細(xì)胞骨架張力可以調(diào)節(jié)zyxin 蛋白，其介導(dǎo)人PDL成纖維細(xì)胞中YAP的核轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，YAP是否參與剪切應(yīng)力介導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖以及上游調(diào)節(jié)因子尚不清楚。

基于此，北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院北京生物醫(yī)學(xué)工程高精尖中心、生物力學(xué)與力學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)研究探討了流體剪切應(yīng)力（FSS）介導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞增殖機(jī)制，研究結(jié)果為PDL細(xì)胞增殖作為PDL組織再生的可行方法提供了新的見解，對p38-AMOT-YAP機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的觀察為牙齒運(yùn)動(dòng)和牙齒矯形提供了啟示。

FSS促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖并重排細(xì)胞骨架和核形狀

為了研究FSS對PDL細(xì)胞增殖的影響，用1、3、6和9 dyn/cm2的 FSS 持續(xù)4小時(shí)來量化EdU陽性PDL細(xì)胞。在這項(xiàng)研究中，1-6 dyn/cm2的FSS促進(jìn)細(xì)胞增殖，但9 dyn/cm2的FSS抑制細(xì)胞增殖。此外，6 dyn/cm2 的FSS效果zui'好，EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量從24.41%±4.01%增加到43.13%±6.03%（圖1 A、B）。因此，實(shí)驗(yàn)選擇了 6 dyn/cm2的FSS在隨后的實(shí)驗(yàn)中。

將PDL細(xì)胞暴露于6 dyn/cm2的FSS，與靜態(tài)對照相比，細(xì)胞保持了更高的活力（圖1 C）。為了研究FSS對PDL細(xì)胞骨架重塑的影響，將PDL細(xì)胞暴露于6 dyn/cm2 FSS中持續(xù)5分鐘，10分鐘，30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)和4小時(shí)，結(jié)果增加了F-肌動(dòng)蛋白絲的密度（圖1 D、E）。投影面積減小，細(xì)胞形狀指數(shù)呈時(shí)間依賴性增加（圖1 F、G），表明FSS可以將細(xì)胞形狀改變?yōu)楦「鼒A。接下來，研究了FSS介導(dǎo)的細(xì)胞粘附。有趣的是，F(xiàn)SS似乎在二相模型中調(diào)節(jié)FAK和Paxillin。它在1-5分鐘后增加了FAK和Paxillin的長度。然而，這些參數(shù)在FSS超過30分鐘后下降（圖1 D、H）。

當(dāng)FSS持續(xù)5分鐘-4小時(shí)時(shí)，核厚度在10分鐘內(nèi)下降，并在30分鐘后增加。核面積在10分鐘內(nèi)增加，并在30分鐘后降低（圖1 I-K）。然而，F(xiàn)SS沒有改變核體積（圖1 L），表明在FSS的10分鐘內(nèi)，細(xì)胞核變得更平坦，但在30分鐘后，它們達(dá)到了更立體的形狀。肌動(dòng)蛋白帽在10 分鐘內(nèi)增加，30 分鐘后減小（圖1 M、N），肌動(dòng)蛋白帽的總熒光強(qiáng)度與核厚度呈高度相關(guān)（圖1 O），表明FSS促進(jìn)肌動(dòng)蛋白帽擴(kuò)增和壓縮細(xì)胞核。然后進(jìn)一步研究了FSS在10分鐘內(nèi)對核孔的影響。結(jié)果表明，5-10 分鐘的FSS擴(kuò)張了核孔徑（圖1 P、Q）。

圖1   FSS促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖，重新排列細(xì)胞骨架，改變細(xì)胞核形狀。

YAP參與FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖

接下來研究了YAP在FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖中的作用。結(jié)果表明，YAP在FSS的持續(xù)時(shí)間內(nèi)顯示出動(dòng)態(tài)易位。它們在5-10分鐘內(nèi)響應(yīng)FSS在細(xì)胞核中積聚。然而，在FSS持續(xù)的30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)或4小時(shí)后，YAP被排除在細(xì)胞核之外。YAP比值的N/C與核厚度高度相關(guān)，表明核形狀的變化影響YAP核定位。核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（LMB）阻斷FSS誘導(dǎo)的YAP轉(zhuǎn)錄輸出1小時(shí)，這表明核孔輸出對于FSS誘導(dǎo)的YAP至關(guān)重要。YAP的Ser127是LATS1/2的關(guān)鍵靶點(diǎn)，F(xiàn)SS將其下調(diào)。YAP靶基因，如CTGF和ANKRD30，在4 分鐘-2 小時(shí)FSS下被促進(jìn)，表明下游基因被FSS持續(xù)激活。這些結(jié)果表明，盡管FSS誘導(dǎo)的YAP定位是動(dòng)態(tài)的，但下游基因的激活及其抑制的磷酸化持續(xù)存在。當(dāng)敲低YAP時(shí)，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖被阻斷。這些結(jié)果表明，F(xiàn)SS調(diào)控的YAP在FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用。

LATS1/2是調(diào)節(jié)Hippo 通路中YAP激活的上游激酶。數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)SS可以調(diào)節(jié)LATS1/2活性，從而調(diào)節(jié)YAP的定位和激活。當(dāng)LATS1/2沉默時(shí)，即使在對照細(xì)胞中，F(xiàn)SS也未能促進(jìn)細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，LATS參與FSS誘導(dǎo)的YAP調(diào)控，并在FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。

p38通過調(diào)節(jié)PDL細(xì)胞中的LATS和YAP來調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖

據(jù)報(bào)道MAPK信號通路可調(diào)節(jié)YAP活性。在研究中，6 dyn/cm2 的FSS可以在5-30分鐘內(nèi)快速激活ERK、p30和JNK。當(dāng)PDL細(xì)胞分別用ERK，p38和JNK抑制劑預(yù)處理時(shí)，p38抑制劑（而不是JNK和ERK抑制劑）減少了FSS誘導(dǎo)的YAP核聚集。被FSS降低的pYAP表達(dá)被p38抑制劑恢復(fù)，但JNK或ERK抑制劑不能。CTGF和ANKRD1的表達(dá)也有類似的趨勢。因此進(jìn)一步研究了p38的作用，發(fā)現(xiàn)FSS誘導(dǎo)的增殖被p38抑制劑顯著破壞，但JNK和ERK抑制劑沒有。由于FSS下調(diào)了pLATS1，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有p38抑制劑可以在FSS下挽救pLATS1表達(dá)。這些結(jié)果表明，p38通過抑制LATS磷酸化和促進(jìn)YAP活性來調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。

細(xì)胞骨架和LINC調(diào)控FSS誘導(dǎo)的YAP定位

已知YAP受細(xì)胞骨架高度調(diào)控。為了研究細(xì)胞骨架在FSS誘導(dǎo)的YAP定位中的作用，使用不同的細(xì)胞骨架抑制劑：細(xì)胞松弛素D（Cyto D）、Rho激酶抑制劑Y-27632、非肌肉肌球蛋白II型ATP酶抑制劑Bleb，以干擾細(xì)胞骨架的不同方面。結(jié)果表明，F(xiàn)SS下肌動(dòng)蛋白絲受損符合YAP的核排出。相反，當(dāng)細(xì)胞與促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合的誘導(dǎo)劑Jasp孵育時(shí)，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的YAP的核定位增加（圖2 A、B），表明肌動(dòng)蛋白絲的完整性在FSS誘導(dǎo)的YAP定位中起重要作用。這些細(xì)胞骨架試劑也調(diào)節(jié)細(xì)胞核形狀。細(xì)胞骨架抑制劑受損提高了核高度并減少了核面積。然而，Jasp具有相反的效果（圖2 C-F）。已知LINC復(fù)合物將力從細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞骨架傳遞到細(xì)胞核。當(dāng)沉默將肌動(dòng)蛋白連接到LINC的nesprin1時(shí)，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的F-肌動(dòng)蛋白形成和YAP核定位受到阻礙（圖2 G、H）。當(dāng)nesprin1被敲低時(shí)，F(xiàn)SS促進(jìn)的F-肌動(dòng)蛋白和paxillin 也降低（圖2 I）。沉默的nesprin1取消了FSS增加的肌動(dòng)蛋白帽和核扁平化（圖2 J-O）。這些結(jié)果表明，LINC對于FSS從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要，它參與了FSS誘導(dǎo)的YAP轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖2   細(xì)胞骨架和LINC參與PDL細(xì)胞中FSS誘導(dǎo)的YAP定位。

p38 影響 Akt/cofilin 和 LATS 以調(diào)節(jié) FSS 誘導(dǎo)的 PDL 細(xì)胞中 F-肌動(dòng)蛋白聚合

Akt和cofilin是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合的關(guān)鍵因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在FSS作用5-30分鐘后，pAkt/Akt的表達(dá)增加，而Akt表達(dá)沒有變化（圖3 A）。此外，pcofilin/cofilin的水平也在FSS作用5-30分鐘后上調(diào)，而cofilin水平?jīng)]有影響（圖3 B）。當(dāng)cofilin沉默時(shí)，F(xiàn)SS上調(diào)YAP核定位，下游基因表達(dá)進(jìn)一步增加，趨勢與F-肌動(dòng)蛋白形成相同（圖3 C-G）。當(dāng)使用Akt抑制劑MK2206和PI3K抑制劑LY294002時(shí)，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的pcofilin表達(dá)受到抑制（圖3 H）。當(dāng)PDL細(xì)胞與p38抑制劑預(yù)培養(yǎng)并加載6 dyn/cm2的FSS 時(shí)，pAkt/Akt和pcofilin/cofilin，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的水平降低（圖3 I-L）。這表明，p38對肌動(dòng)蛋白聚合至關(guān)重要。

為了證明LATS1和Akt的關(guān)系，將MK-2206與PDL細(xì)胞一起孵育以抑制Akt活性。結(jié)果表明，被FSS降低的pLATS1/LATS1表達(dá)被Akt抑制劑恢復(fù)（圖3 M）。相反，敲低LATS1/2幾乎沒有影響FSS介導(dǎo)的Akt活性。由于p38可以抑制pLATS水平，因此當(dāng)沉默LATS1/2，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白密度增加，并且對FSS沒有反應(yīng)（圖3 N、O）。當(dāng)LATS1/2被敲低時(shí)，對照組中肌動(dòng)蛋白帽增加，F(xiàn)SS不能增強(qiáng)（圖3 P、Q）。沉默LATS1/2進(jìn)一步增加了FSS誘導(dǎo)的核扁平化，對FSS調(diào)節(jié)沒有反應(yīng)（圖3 R-U）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)SS激活了p38，隨后激活了Akt，Akt磷酸化cofilin，促進(jìn)了F-肌動(dòng)蛋白聚合。Akt的激活參與了LATS磷酸化的抑制。受p38抑制的LATS負(fù)調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白，肌動(dòng)蛋白帽形成和核扁平化。因此，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的F-肌動(dòng)蛋白聚合增加了YAP核易位。

圖3   p38影響Akt/cofilin和LATS調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白聚合。

AMOT負(fù)調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞中YAP轉(zhuǎn)運(yùn)

據(jù)報(bào)道，AMOT家族可以與幾種Hippo 通路成分相互作用并調(diào)節(jié)YAP活性。有趣的是，這些研究表明AMOT被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，其模式類似于FSS誘導(dǎo)的YAP定位。AMOT N/C比相對于核厚度較高。FSS在5-10分鐘內(nèi)抑制AMOT的磷酸化。當(dāng)沉默AMOT時(shí)，YAP核定位增加，對FSS沒有反應(yīng)。下游基因，如CTGF和ANKRD1，表現(xiàn)出相同的趨勢。AMOT的敲低促進(jìn)了FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖。當(dāng)AMOT被沉默時(shí)，F(xiàn)SS加速增殖不受FSS調(diào)控。這表明AMOT是一種負(fù)調(diào)節(jié)因子，是FSS誘導(dǎo)的YAP核定位和細(xì)胞增殖所必需的。為了研究潛在的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)研究了AMOT與F-肌動(dòng)蛋白和YAP的相互作用。結(jié)果表明，F(xiàn)SS可以增加AMOT與F-肌動(dòng)蛋白的結(jié)合并減少AMOT-YAP相互作用。當(dāng)沉默YAP時(shí)，AMOT-F-肌動(dòng)蛋白相互作用在FSS下進(jìn)一步增強(qiáng)。當(dāng)通過Bleb抑制F-肌動(dòng)蛋白聚合時(shí)，AMOT-YAP相互作用得到促進(jìn)。當(dāng)使用Jasp時(shí)，在FSS下AMOT-YAP相互作用降低。這些結(jié)果表明，AMOT可以與F-actin和YAP競爭性結(jié)合。F-肌動(dòng)蛋白的聚合促進(jìn)了AMOT與F-肌動(dòng)蛋白的相互作用。

為了進(jìn)一步研究AMOT的調(diào)控機(jī)制，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siYAP抑制了FSS介導(dǎo)的AMOT核定位（圖4 A、B）。當(dāng)使YAP陰性調(diào)節(jié)因子LATS1/2沉默時(shí)，AMOT核定位增加并且對FSS沒有反應(yīng)（圖4 C、D）。siLATS1/2也降低了它們的磷酸化（圖4 E），表明LATS1/2可以調(diào)節(jié)pAMOT和FSS誘導(dǎo)的核定位。AMOT還可以調(diào)節(jié)LATS1的磷酸化。當(dāng)沉默AMOT時(shí)，F(xiàn)SS抑制的磷酸化進(jìn)一步下降，并且不再受FSS調(diào)節(jié)（圖4 F）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)SS抑制pLATS1，影響pAMOT及其核定位。AMOT可以磷酸化LATS1。AMOT的核定位部分取決于YAP核轉(zhuǎn)運(yùn)（圖4 G）。

圖4   YAP和LATS調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的AMOT磷酸化和定位。

（G）FSS如何調(diào)節(jié)p38并進(jìn)一步影響YAP核易位以促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖的示意圖。

在這項(xiàng)研究中，報(bào)道了FSS可以通過p38-AMOT-YAP促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖。FSS激活p38，抑制pLATS并上調(diào)YAP活性。此外，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的p38表達(dá)還激活了Akt和pcofilin，促進(jìn)了肌動(dòng)蛋白帽和F-肌動(dòng)蛋白聚合，使細(xì)胞核變平，擴(kuò)增了核孔徑，從而增加了YAP核易位。F-肌動(dòng)蛋白招募AMOT進(jìn)行結(jié)合并從YAP-AMOT復(fù)合物中釋放YAP。研究結(jié)果表明，F(xiàn)SS是PDL細(xì)胞擴(kuò)增的有前途的工具，還揭示了YAP機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，這將有利于未來的牙齒再生。

參考文獻(xiàn)：Shi Q, Zheng L, Na J, Li X, Yang Z, Chen X, Song Y, Li C, Zhou L, Fan Y. Fluid shear stress promotes periodontal ligament cells proliferation via p38-AMOT-YAP. Cell Mol Life Sci. 2022 Oct 16;79(11):551. doi: 10.1007/s00018-022-04591-w. PMID: 36244032.

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