人類牙周韌帶來源的干細胞（PDLSCs）是牙周韌帶（PDL）中的主要功能性骨祖細胞，通過機械傳感和信號傳導參與適應性活動。目前對調節PDLSCs中成骨活性的機械力誘導的細胞內信號級聯的研究已經獲得了進展。然而，關于將外在機械應力與內在生化反應聯系起來的機械傳感器的知識是有限的。

盡管在機械力誘導的PDLSCs中，已經發現了一些用于控制成骨的膜嵌入蛋白，但許多位于或橫跨細胞膜上的感覺元件仍有待定義。LRP6是一種Wnt跨膜受體，通過激活Wnt/β-連環蛋白信號通路在細胞機械傳感中發揮一系列重要作用。最近，LRP6被發現是參與牙齒發育、少牙畸形和口腔鱗狀細胞癌等牙齒生理和病理活動的關鍵調節因子。因此，推測PDLSCs中的LRP6是一種候選響應傳感器，可響應機械應力并介導成骨作用。

基于此，山東大學口腔醫學院口腔正畸科、山東省口腔組織再生重點實驗室等聯合團隊的一項研究旨在闡明在正畸牙齒移動（OTM）期間機械誘導的PDLSCs中調節成骨活動的關鍵傳感器機械信號。

LRP6在機械力誘導的PDLSCs和PDL組織中的表達增強

在體外，將培養的細胞暴露于循環拉伸應力（CSS，10% 伸長率，0.5 Hz）中6，12和24小時，模擬體內機械力負荷。與無拉伸組相比，LRP6的表達呈時間依賴性上調，拉伸24 h上調最為明顯。磷酸化的LRP6（P-LRP6）表現出相同的趨勢。CSS加載上調了P-LRP6/總LRP6的蛋白質水平比值，且在24 h觀察到zui顯著的變化。免疫熒光證實，拉伸24 h 后LRP6顯著升高。因此，后續的研究中采用了拉伸24小時。

這些數據表明，LRP6可能與PDLSCs對機械力的響應有關。此外，HE染色顯示PDL組織張力側的體內分散。實驗觀察到LRP6表達分布在整個牙周組織中，其表達從第0-7天逐漸上調。第14天LRP6表達量較第3天和第7天下降。這些數據進一步暗示LRP6可能參與OTM期間的牙槽骨重塑。

LRP6失活抑制了機械力誘導的PDLSCs中的成骨作用

LRP6在機械力誘導的PDLSCs中的表達升高，伴隨著增殖和成骨能力的提高，表現為增殖標志物（PCNA）和成骨標志物（ALP和RUNX2）的表達顯著增加（圖1 a、b）。接下來，實驗通過構建慢病毒載體抑制LRP6表達，以闡明LRP6在PDLSCs中機械力依賴性成骨性能中的作用。拉伸6 h后，sh-LRP6組P-LRP6和LRP6的蛋白水平顯著下調（圖1 c）。LRP6的mRNA表達也發生相同變化（圖1 d），且sh-LRP6組中P-LRP6/總LRP6的比例升高，表明與總蛋白相比磷酸化下降趨勢較慢（圖1 e）。此外，LRP6敲低減弱了增殖標志物（PCNA）和成骨標志物（ALP，RUNX2，OSX）的表達（圖1 f、g）。同時，在sh-LRP6組中Ki-67陽性細胞的比例顯著下降（圖1 h、i），ALP染色顯著減弱（圖1 j），ALP活性顯著降低（圖1 k），驗證了LRP6缺失細胞的增殖和成骨能力降低。這些數據表明，LRP6參與調節PDLSCs的機械力依賴性增殖和成骨分化。

圖1   LRP6失活抑制了機械力誘導的PDLSC中的成骨作用。

LRP6失活破壞了機械力誘導的PDLSCs中的F-肌動蛋白動力學

令人驚訝的是，在sh-LRP6組中觀察到細胞面積和形態的異常變化，其中LRP6缺失細胞在拉伸24 h后接觸面積明顯增大，細胞圓度變小，寬長比降低。肌動蛋白細胞骨架重排對于維持機械力誘導的細胞形狀是必要的。因此，實驗假設LRP6是機械力誘導PDLSCs中F-肌動蛋白動力學的關鍵調節因子。實際上，在CSS下的sh-LRP6組中β-肌動蛋白單體合成和F-肌動蛋白聚合受到嚴重抑制。在機械力誘導的PDLSCs中，F-肌動蛋白動力學所需的F-肌動蛋白上游調節因子（RHOA和ROCK1）的表達也顯著降低。此外，在 CSS 下的 sh-LRP6 組中 F-肌動蛋白定向紊亂且明顯拉長，連續性也顯然被破壞。LRP6缺失細胞中F-肌動蛋白密度也顯著降低。這些數據表明，激活LRP6促進了機械力誘導的PDLSCs中的F-肌動蛋白動力學，并可能在OTM期間促進PDL組織的結構穩態。

破壞F-肌動蛋白動力學抑制了機械力誘導的PDLSCs中的成骨作用

然后實驗研究了LRP6介導的F-肌動蛋白動力學是否參與機械力依賴性成骨作用。首先在力誘導的PDLSCs和PDL組織中檢測到β-肌動蛋白表達。與LRP6表達模式一致的β-肌動蛋白的表達從第0-7天顯示出顯著的積累，并在體內第14天略有下降（圖2 a、b），但在體外拉伸后穩定升高（圖2 c-e）。這些數據進一步證實，PDLSCs中的LRP6的缺失破壞了機械力誘導的F-肌動蛋白組裝。

接下來，使用有效的肌動蛋白聚合抑制劑Cyto D研究了F-肌動蛋白動力學對PDLSCs中機械力依賴性成骨性能的作用。如圖2 f、g 所示，Cyto D抑制ALP、RUNX2、OSX和PCNA的表達，同時抑制β-肌動蛋白的表達。然后，Cyto D引起的Ki-67陽性細胞比例的顯著降低（圖2 h）和ALP染色的弱化（圖2 i），驗證了由于F-肌動蛋白動力學破壞而導致PDLSCs中力依賴性成骨作用的減弱能力。因此，實驗確定F-肌動蛋白是LRP6信號傳導的關鍵下游分支，調節PDLSCs中機械力依賴性的成骨作用。

圖2   破壞的F-肌動蛋白動力學抑制了力誘導的PDLSC中的成骨作用。

LRP6/F-肌動蛋白軸調節機械力誘導的PDLSCs中YAP核易位和激活

YAP通過穿梭進入細胞核起作用，是PDLSCs中機械力依賴性成骨作用的關鍵轉錄介質。研究人員推測YAP作為與LRP6 / F-肌動蛋白軸信號協調的關鍵傳感器，最終有助于PDLSCs中的力依賴性成骨作用。因此，首先研究了LRP6表達與YAP定位、磷酸化和轉錄活性之間的關系。LRP6敲低將核YAP重新定位到細胞質，盡管YAP在CSS加載后主要集中在細胞核中（圖3 a、b）。同時，觀察到LRP6敲低誘導YAP磷酸化（圖3 c、d）。值得注意的是，YAP靶基因在LRP6缺失細胞中的表達顯著降低（圖3 e）。此外，Cyto D還將核YAP重新定位到機械力誘導的PDLSCs中的細胞質上（圖3 f、g），且誘導YAP磷酸化（圖3 h、i），降低YAP靶基因表達（圖3 j）。這些數據表明，PDLSCs中的LRP6敲低干擾了F-肌動蛋白動力學，進一步調控YAP核易位和隨后的轉錄反應（圖4）。

圖3   LRP6 / F-肌動蛋白軸調節機械力誘導PDLSC中的YAP核易位和活化。

圖4   所提出機制的示意圖。

在由正畸應用引起的牙槽骨重塑過程中，機械力增強了PDLSCs中的LRP6膜定位。隨后LRP6動員促進F-肌動蛋白聚合和重排，并進一步促進YAP穿梭到細胞核。活化的YAP隨后促進細胞增殖和成骨分化，最終導致新的骨形成。

綜上所述，這項研究揭示了一種du'te的機械轉導機制，用于控制成骨性能，以LRP6為中心，將機械線索連接到機械力誘導的PDLSCs中的F-肌動蛋白/ YAP級聯。這些結果揭示了OTM的分子基礎。

參考文獻：Wang J, Yang H, Ma X, Liu J, Li L, Chen L, Wei F. LRP6/filamentous-actin signaling facilitates osteogenic commitment in mechanically induced periodontal ligament stem cells. Cell Mol Biol Lett. 2023 Jan 24;28(1):7. doi: 10.1186/s11658-023-00420-5. PMID: 36694134; PMCID: PMC9872397.

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