椎間盤退行性病變（DDD）是腰痛的重要病因。DDD的發病機制復雜，包括機械負荷過大、創傷、炎癥、遺傳、衰老、肥胖、營養不良等。椎間盤（IVD）纖維環（AF）的物理損傷是脊柱退行性改變的重要原因。過度的機械拉伸會改變AF細胞的數量和表型，從而降低AF的彈性，導致IVD進一步損傷和退化。此外，AF細胞具有祖細胞的特性，可以在體外和體內分化為軟骨細胞和成骨細胞。因此，研究AF細胞上成骨的信號通路對于闡明DDD的發病機制非常重要。

BMPs（人骨形態發生蛋白）是轉化生長因子-β（TGF-β）超家族的成員，具有誘導干細胞分化為成骨細胞并促進骨形成的潛力。BMP-2及其I型和II型受體的表達已在小鼠IVD的纖維細胞中觀察到。BMP-2/4及其I型和II型受體在50周齡衰老加速小鼠AF內的纖維軟骨細胞中強烈表達，因此似乎與IVD的變性有關。到目前為止，許多研究已經使用包含兩個BMP基因的異源二聚體配體來闡明BMP異源二聚體的廣泛生物學作用，并且不同BMP配體的共表達可導致異源二聚體配體的形成。然而，BMP-2/6異源二聚體在IVD變性的發病機制中的作用尚未得到很好的研究。

因此，國立嘉義大學生化科學與技術系及食品科學系、成功大學醫院附設醫院骨科的一項聯合研究的目的是確定BMP-2/6異源二聚體在IVD中的作用，以及IVD中機械拉伸與成骨反應之間的因果關系以及IVD變性的信號通路。

HCS 上調人 AF 細胞中的成骨基因表達

為了測試循環拉伸是否可以啟動與IVD成骨相關的基因表達，對人AF細胞進行培養并接受循環拉伸方案，其中輕度循環拉伸（LCS，5%）或高度循環拉伸（HCS，15%）持續不同時間（圖1）。實驗檢測了HCS處理是否能夠在AF細胞中誘導Runx2、osterix和OPN表達。結果表明，與對照和LCS處理的細胞相比，受HCS刺激4 h的AF細胞顯著誘導Runx2、osterix、OPN 的mRNA（圖1 A）和蛋白質（圖1 B）表達增加。此外，Runx2、osterix、OPN 的mRNA（圖1 C）和蛋白質（圖1 D）水平測定的時間過程顯示，在HCS處理的AF細胞中，1小時內升高，并持續8小時。

Runx2是成骨基因表達的關鍵轉錄因子，因此研究了Runx2是否可以調節HCS對AF細胞中osterix和OPN表達的影響。結果表明，用 Runx2 特異性 siRNA 預處理細胞可顯著抑制 HCS 誘導的 osterix 和 OPN 的mRNA 和蛋白質在AF細胞中的表達，這說明Runx2 參與 HCS 誘導的成骨。

圖1   HCS 上調人 AF 細胞中的成骨基因表達。

BMP-2/6 異源二聚體介導拉伸誘導的成骨基因表達

BMPs是成骨分化的主要調節因子。因此，實驗確定了HCS處理引發的成骨基因表達是否會通過上調人AF細胞中的BMPs而產生。結果表明，與對照組相比，經HCS處理的AF細胞中BMP-2和BMP-6的mRNA表達顯著增加（圖2 A）。此外，用針對BMP-2（Ab-BMP-2）和BMP-6（Ab-BMP-6）的中和抗體預處理的細胞顯著抑制了HCS對AF細胞中Runx2、osterix和OPN基因（圖2 B）和蛋白質（圖2 C）表達的上調作用。在重組蛋白實驗中，BMP-2和BMP-6均不能上調Runx2和osterix的基因和蛋白表達，而BMP-2/6在相同濃度下誘導Runx2和 osterix 的顯著表達。這些結果可推測，當BMP-2或BMP-6的濃度不足以誘導基因和蛋白質表達時，BMP-2/6可有效誘導Runx2和osterix表達。

圖2   BMP-2/6異源二聚體介導拉伸拉伸誘導的成骨基因表達。

HCS 誘導的 Runx2 表達依賴于 p38 MAPK

MAPK通路已被證明可以調節許多細胞過程，包括成骨基因表達。為了研究MAPKs參與HCS誘導調節Runx2表達的情況，在HCS刺激之前和期間用MAPKs的特異性抑制劑（用于ERK的PD98059，用于JNK的SP600125，用于p38的SB203580）處理人AF細胞1小時。結果發現，SB203580可顯著抑制HCS誘導的Runx2 基因（圖3 A）和蛋白質（圖3 B）表達。HCS誘導后AF細胞中p38的磷酸化迅速增加，在1-2小時達到zui大水平（圖3 C）。此外，與對照和LCS處理的細胞相比，受HCS刺激1小時的細胞顯著誘導AF細胞中的p38磷酸化。

圖3   HCS 誘導的 Runx2 表達依賴于 p38 MAPK。

SAMD1/5/8 參與循環拉伸誘導的 Runx2 表達

將BMP信號傳輸到細胞核所需的SMAD蛋白已被證明可以誘導成骨基因表達。實驗研究了SMAD1/5/8是否可以調節HCS誘導的人AF細胞中的Runx2表達。結果表明，與對照相比，HCS處理的AF細胞的在1小時內顯著誘導SMAD1/5/8 的磷酸化，并持續8小時（圖4 A）。與對照和LCS處理的細胞相比，由HCS刺激4小時的人AF細胞顯著誘導SMAD1/5/8的磷酸化（圖4 B）。用SMAD1特異性siRNA預處理細胞顯著抑制HCS處理誘導的Runx2 mRNA（圖4 C）和蛋白質（圖4 D）表達。

圖4   SAMD1/5/8參與HCS誘導的Runx2表達。

抑制 ALK3 受體降低循環拉伸誘導的成骨基因表達

據報道，BMP-2/6異源二聚體可以結合和激活ALK3受體，并進一步影響宿主細胞基因的表達。為了評估ALK3在HCS刺激的AF細胞成骨表型中的作用，實驗評估了ALK3-siRNA和抑制劑（LDN）對HCS誘導的人AF細胞中Runx2和osterix表達的影響。結果表明，HCS誘導的Runx2和osterix的mRNA表達通過ALK3-siRNA或LDN處理顯著降低（圖5 A）。此外，HCS誘導的Runx2和osterix的蛋白表達在用LDN預處理的AF細胞中也被抑制（圖5 B）。此外，在用LDN預處理的細胞中，由rhBMP-2/6 異源二聚體刺激的Runx6 mRNA表達在AF細胞中受到顯著抑制（圖5 C）。

圖5   抑制ALK3受體可降低HCS誘導的成骨基因表達。

IVD 損傷患者的成骨基因表達

圖6 表現為IVD損傷患者手術切除組織中的成骨基因表達。退行性IVD和LF組織均表現出成骨表型，這通過Runx2（圖6 A）、osterix（圖6 B）和 OPN （圖6 C）的mRNA表達的增加證實。成骨基因在AF組織中的表達水平高于黃韌帶（LF）組織。

圖6   IVD 損傷患者的成骨基因表達。

圖7   影響人 AF 細胞中 15% 循環拉伸誘導的 BMP-2/6 表達和隨后的成骨調控的可能機制的示意圖。

總之，該研究結果提供了有關HCS誘導人AF細胞成骨基因表達的機制的信息。研究發現，用HCS刺激人AF細胞導致BMP-2/6異二聚體介導的信號通路的激活。抑制ALK3活性可能是控制AF細胞成骨的有效方法。HCS還誘導p38 MAPK和SMAD1/5/8信號通路的激活，并最終增強Runx2和osterix在人AF細胞中的表達。此外，還發現人類退行性IVD組織比LF組織具有更高的成骨基因表達。這些發現為人類AF細胞中機械拉伸和細胞信號傳導相互作用的機制提供了見解，這可能參與DDD的進展，并可用于DDD患者IVD變性的未來治療干預。

參考文獻：Chen CN, Chang HI, Yen CK, Liu WL, Huang KY. Mechanical Stretch Induced Osteogenesis on Human Annulus Fibrosus Cells through Upregulation of BMP-2/6 Heterodimer and Activation of P38 and SMAD1/5/8 Signaling Pathways. Cells. 2022 Aug 20;11(16):2600. doi: 10.3390/cells11162600. PMID: 36010676; PMCID: PMC9406707.

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