椎間盤（IVD）是連結(jié)相鄰兩個(gè)椎體的纖維軟骨盤，由3個(gè)部分組成：髓核（NP）、纖維環(huán)（AF）和軟骨板（CEPs）。NP的退變被認(rèn)為是椎間盤退變（IVDD）的關(guān)鍵步驟。退變的NP變成無(wú)組織的纖維組織團(tuán)塊，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分發(fā)生改變，主要失去其結(jié)合水的能力。退變的NP內(nèi)的壓力降低，椎間盤高度降低，導(dǎo)致IVDD和脊柱生物力學(xué)不穩(wěn)定。NP在IVDD期間經(jīng)歷了最高程度的重塑。

大量復(fù)雜因素導(dǎo)致椎間盤退化，通常涉及生物力學(xué)和生物機(jī)制之間的協(xié)同相互作用。在它們的相互作用過(guò)程中，力學(xué)因素、細(xì)胞生物代謝反應(yīng)和水結(jié)合ECM在退化中起重要作用。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT通路控制許多基本的細(xì)胞功能，并參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期和凋亡。據(jù)報(bào)道，PI3K/AKT通路參與調(diào)節(jié)NP細(xì)胞增殖、凋亡、衰老和ECM代謝，并且還顯示其與NP變性顯著相關(guān)。然而，調(diào)控NP退變的機(jī)制和生物相互作用機(jī)制尚未深入探討。

基于此，山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬頸肩腰腿痛醫(yī)院、山東中醫(yī)藥大學(xué)、河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院、zhong'guo'ren'min'jie'fang'jun第960醫(yī)院等研究團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究曾探討了循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，以及ITGA2/PI3K/AKT通路在響應(yīng)循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞影響中的作用。研究結(jié)果可能提供潛在的靶點(diǎn)和逆轉(zhuǎn)IVDD退行性變化的可能性。

循環(huán)機(jī)械拉伸促進(jìn)NP細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程

研究首先以0.1 Hz，10% 的拉伸幅度對(duì)NP細(xì)胞進(jìn)行8640次循環(huán)拉伸應(yīng)力（ 2秒拉伸，5秒保持，2秒恢復(fù)，1秒休息為1個(gè)循環(huán)），探討了循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。結(jié)果表明，拉伸應(yīng)力組NP細(xì)胞形狀不規(guī)則，生長(zhǎng)狀態(tài)完整，折光性強(qiáng)。然后評(píng)估了循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞增殖的影響。如圖1 a，NP細(xì)胞在拉伸應(yīng)力組的生長(zhǎng)速度顯著高于對(duì)照組。然后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)細(xì)胞周期的影響。拉伸應(yīng)力組和對(duì)照組G1期、S期和G2/M期NP細(xì)胞的百分比分別為41.22±5.17% vs 41.71%±2.45%、20.74±2.32% vs 32.47±1.95%、22.27±2.91% vs 15.53±0.78%（圖1 c、d）。與對(duì)照組相比，拉伸應(yīng)力組S期NP細(xì)胞百分比顯著降低（圖1 b）。拉伸應(yīng)力組G2/M期NP細(xì)胞百分比顯著高于對(duì)照組（圖1 b）。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應(yīng)力顯著促進(jìn)了NP細(xì)胞從S期向G2/M期的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變。

圖1   循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。

（a） MTS測(cè)定顯示，循環(huán)機(jī)械拉伸促進(jìn)NP細(xì)胞增殖。（b）循環(huán)機(jī)械拉伸顯著促進(jìn)了NP細(xì)胞從S期向G2/M期的進(jìn)展。（c）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示對(duì)照組中G1，S和G2/M期NP細(xì)胞的百分比。（d）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示拉伸應(yīng)力組中 G1、S 和 G2/M 期 NP 細(xì)胞的百分比。

循環(huán)機(jī)械拉伸抑制NP細(xì)胞凋亡

接下來(lái)分析了循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞凋亡的影響。拉伸組和對(duì)照組NP細(xì)胞凋亡百分比分別為8.99±0.88%和10.75±0.40%（圖2 a、b）。與對(duì)照組相比，拉伸組凋亡NP細(xì)胞百分比較低（圖2 c），表明循環(huán)機(jī)械拉伸抑制了NP細(xì)胞的凋亡。

這些結(jié)果表明，循環(huán)機(jī)械拉伸可能通過(guò)調(diào)節(jié)NP細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和凋亡來(lái)影響NP的退變。綜合以往報(bào)道的研究，研究結(jié)果表明，高機(jī)械拉伸可能會(huì)促進(jìn)NP細(xì)胞凋亡和變性，而適度的機(jī)械拉伸可能會(huì)抑制NP細(xì)胞凋亡，促進(jìn)NP細(xì)胞增殖，并可能改善NP變性。

圖2   循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞凋亡的影響。

（a）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析的對(duì)照組中凋亡NP細(xì)胞的百分比。（b）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析的拉伸應(yīng)力組中凋亡NP細(xì)胞的百分比。（c）循環(huán)機(jī)械拉伸抑制NP細(xì)胞的凋亡。

循環(huán)機(jī)械拉伸刺激 NP 細(xì)胞中的差異表達(dá)基因

為了闡明循環(huán)機(jī)械拉伸影響NP細(xì)胞的機(jī)制，進(jìn)行了微陣列分析以檢查響應(yīng)循環(huán)機(jī)械拉伸的效應(yīng)基因。結(jié)果顯示，拉伸組與對(duì)照組共有689個(gè)候選基因表達(dá)存在顯著差異，其中333個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，356個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

然后進(jìn)行了GO功能注釋，該分析由三個(gè)主要分支組成，即生物過(guò)程（BP），分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）。結(jié)果顯示，BP類主要基因?yàn)榛虮磉_(dá)、細(xì)胞增殖分裂、凋亡過(guò)程的正向調(diào)控，MF類基因以ECM結(jié)構(gòu)成分為主，CC類包括粘附斑和ECM。NP細(xì)胞增殖、凋亡和ECM代謝異常已被證明會(huì)導(dǎo)致NP變性。微陣列結(jié)果顯示，參與這些生物學(xué)功能和過(guò)程的具有顯著差異表達(dá)的基因與NP變性密切相關(guān)。

此外，還基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析了與信號(hào)通路相關(guān)的所有差異表達(dá)基因（DEG）的參與情況。在與循環(huán)機(jī)械拉伸刺激相關(guān)的shi'da富集信號(hào)通路中通路PI3K/AKT。據(jù)報(bào)道，PI3K/AKT通路參與NP細(xì)胞凋亡、衰老和ECM降解的調(diào)節(jié)，與NP變性顯著相關(guān)。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PI3K/AKT信號(hào)通路可能在循環(huán)機(jī)械拉伸介導(dǎo)的NP細(xì)胞效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

共發(fā)現(xiàn)31個(gè)參與PI3K/AKT信號(hào)通路的基因，在兩組之間的表達(dá)存在顯著差異。其中，18個(gè)基因是該通路的陽(yáng)性效應(yīng)子，顯著上調(diào)。相反，13個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)該通路的基因，明顯下調(diào)。因此進(jìn)一步進(jìn)行了qRT-PCR以確認(rèn)微陣列結(jié)果。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，拉伸組NP細(xì)胞中ITGA2、FGF1、COL2A1和BCL2L11的mRNA水平顯著升高，MYC和IL7R mRNA水平明顯降低。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了從微陣列數(shù)據(jù)中得到的發(fā)現(xiàn)。

ITGA2/PI3K/AKT 通路參與循環(huán)機(jī)械拉伸介導(dǎo)的對(duì) NP 細(xì)胞的影響

整合素被廣泛認(rèn)為是IVD細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的主要機(jī)械感受器。整合素通路在脊索細(xì)胞對(duì)機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的IVDD的易感性中起重要作用。ITGA2，也稱為整合素A2，編碼膠原蛋白和其他相關(guān)蛋白質(zhì)的跨膜受體的α亞基。整合素α2β1參與雌激素干預(yù)的PI3K/AKT通路，調(diào)節(jié)椎間盤老化和變性的抗凋亡作用，參與FAK/PI3K信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)IVD變性中NP細(xì)胞的粘附能力和失巢凋亡。然而，ITGA2在循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞變性的影響中的作用尚未闡明。

在這項(xiàng)研究中，進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡以進(jìn)一步證實(shí)循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞中ITGA2 / PI3K / AKT信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的影響。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，拉伸應(yīng)力組ITGA2和p-AKT蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（圖3 a），表明循環(huán)機(jī)械拉伸顯著促進(jìn)了NP細(xì)胞中的ITGA2/PI3K/AKT信號(hào)通路。

為了進(jìn)一步證實(shí)循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)ITGA2 / PI3K / AKT信號(hào)通路的功能影響，使用siRNAs敲低NP細(xì)胞中該通路中關(guān)鍵分子的蛋白質(zhì)表達(dá)，即ITGA2和AKT。結(jié)果顯示，ITGA2和AKT蛋白顯著降低（圖3 b），表明ITGA2/PI3K/AKT信號(hào)通路受到抑制。當(dāng)NP細(xì)胞加載循環(huán)機(jī)械拉伸時(shí)，ITGA2和AKT表達(dá)沒(méi)有明顯變化。然后實(shí)驗(yàn)確定了NP細(xì)胞增殖。該通路的抑制顯著抑制了NP細(xì)胞的增殖（圖3 c），而循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)轉(zhuǎn)染siRNA-ITGA2/AKT的NP細(xì)胞增殖沒(méi)有顯著影響。這些結(jié)果表明，ITGA2/PI3K/AKT信號(hào)通路在循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞增殖的影響中起關(guān)鍵作用。

有趣的是，發(fā)現(xiàn)循環(huán)機(jī)械拉伸提高了NP細(xì)胞中COL2A1蛋白的表達(dá)（圖3 a）。在敲低ITGA2/PI1K/AKT信號(hào)通路后，COL2A1蛋白表達(dá)顯著降低（圖3 b）。COL2A1是NP組織中ECM的主要成分，被認(rèn)為是IVD變性的關(guān)鍵分子。這些結(jié)果表明，循環(huán)機(jī)械拉伸可以通過(guò)ITGA2/PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)COL2A1的表達(dá)，并改善NP細(xì)胞的退變。

圖3   PI3K-AKT通路參與循環(huán)機(jī)械拉伸介導(dǎo)的對(duì)NP細(xì)胞的影響。

（a）循環(huán)機(jī)械拉伸促進(jìn)了NP細(xì)胞中的PI3K-AKT通路。ITGA2、p-AKT、AKT和COL2A1的蛋白表達(dá)在拉伸應(yīng)力組中上調(diào)。（b）抑制PI3K-AKT通路。蛋白質(zhì)印跡分析顯示轉(zhuǎn)染siRNA-ITGA2 / AKT的NP細(xì)胞中ITGA2和AKT蛋白表達(dá)的下調(diào)。COL2A1蛋白表達(dá)顯著降低。循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)轉(zhuǎn)染siRNA-ITGA2/AKT的NP細(xì)胞中ITGA2、AKT和COL1A2的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。（c）PI3K-AKT通路的下調(diào)顯著抑制了NP細(xì)胞的增殖。當(dāng)PI3K-AKT通路受到抑制時(shí)，循環(huán)機(jī)械拉伸對(duì)NP細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著影響。

綜上所述，循環(huán)機(jī)械拉伸促進(jìn)了NP細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期從S期向G2期的轉(zhuǎn)變，并抑制了NP細(xì)胞的凋亡。微陣列分析結(jié)果顯示，689個(gè)基因具有顯著的差異表達(dá)。對(duì)調(diào)控信號(hào)通路中所有DEGs的富集分析發(fā)現(xiàn)了PI3K/AKT通路。結(jié)果進(jìn)一步表明，循環(huán)機(jī)械拉伸通過(guò)調(diào)節(jié)ITGA2/PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和COL2A1表達(dá)，改善NP細(xì)胞的退變。這些研究結(jié)果可能提供潛在的靶點(diǎn)和通過(guò)逆轉(zhuǎn)退行性變化來(lái)治療IVDD疾病的可能性。

參考文獻(xiàn)：Wang D, Chen Y, Cao S, Ren P, Shi H, Li H, Xie L, Huang W, Shi B, Han J. Cyclic Mechanical Stretch Ameliorates the Degeneration of Nucleus Pulposus Cells through Promoting the ITGA2/PI3K/AKT Signaling Pathway. Oxid Med Cell Longev. 2021 Mar 16;2021:6699326. doi: 10.1155/2021/6699326. PMID: 33815660; PMCID: PMC7990548.

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