主動脈瓣鈣化疾病（CAVD）是老年人常見的瓣膜疾病，其病理特征包括瓣葉炎癥、纖維化和鈣化。瓣葉慢性炎癥、進行性鈣化和纖維化導致瓣膜功能障礙，最終導致主動脈瓣狹窄和心力衰竭。

越來越多的證據表明，瓣膜炎癥是促進CAVD進展的重要起始事件。據報道，主動脈瓣膜的慢性炎性浸潤與幾種瓣膜病理變化有關，包括纖維化和鈣化。此外，研究發現了促炎介質（如IL-1β和TNF-α）在主動脈瓣組織中的表達。鈣化性主動脈瓣狹窄患者的主動脈瓣的組織學檢查顯示，浸潤包括單核細胞、淋巴細胞、漿細胞和肥大細胞，存在慢性炎癥過程。此外，主動脈瓣膜間質細胞（AVICs）是在維持瓣膜穩態中起重要作用的主要結構和功能細胞，已被發現積極參與CAVD發病機制中的瓣膜炎癥、纖維化和鈣化。研究 AVIC 炎癥過程的潛在機制可為了解 CAVD 發病機制和抑制 CAVD 進展提供重要信息。

浸潤的單核細胞產生炎癥介質，在炎癥部位分化為促炎巨噬細胞。這些細胞能夠通過釋放促炎因子（旁分泌）和/或直接的細胞間相互作用來影響附近的細胞。在患病的主動脈瓣組織中可以觀察到單核細胞浸潤、巨噬細胞積聚和促炎細胞因子水平升高。之前的研究發現，激活的單核細胞能夠通過旁分泌信號使人類AVIC對炎癥反應敏感。目前，關于單核細胞與AVIC的直接相互作用以及這種相互作用對AVIC炎癥活性和瓣膜炎癥的影響知之甚少。

可溶性細胞外基質（ECM）蛋白能夠作為損傷相關分子模式（DAMPs）發揮作用。組織損傷或ECM降解后，隨著可溶性ECM蛋白的釋放產生DAMPs。細胞與可溶性ECM蛋白的相互作用傳遞信號以啟動AVIC中的生物活性。Matrilin-2是Matrilin家族中結締組織分布廣泛的主要成員，組織損傷或應激過程中可溶性Matrilin-2可用作信號分子。此外，據報道，Matrilin-2與炎癥相關的病理生物學過程有關。研究表明，Matrilin-2可以作為DAMPs，刺激人類AVICs產生炎癥反應并且增強其成骨分化活性。目前尚不清楚Matrilin-2是否激活單核細胞，以及單核細胞是否影響AVIC對Matrilin-2的炎癥反應。

在炎癥刺激下，白細胞被募集到炎癥區域，并通過細胞粘附分子與組織常駐細胞相互作用。細胞間粘附分子（ICAM）-1是免疫球蛋白（Ig）樣細胞粘附分子超家族的成員。它在心血管細胞表面上構成性表達并在炎癥狀態下表達水平上調。整合素是一類糖基化的異二聚體跨膜型粘附受體。β2-整合素在白細胞表面表達，作為必需的粘附分子起作用。它介導白細胞粘附到不同細胞。已發現ICAM-1具有受體的功能，可以與白細胞上的β2-整合素相互作用，以調節白細胞在炎癥部位的遷移和粘附。此外，β2-整合素可作為ICAM-1的配體，誘導依賴于ICAM-1的效應細胞活化。因此，單核細胞極有可能通過β2-整合素/ICAM-1 之間的聯結與 AVICs 相互作用以調節AVICs 對促炎刺激的炎癥反應。

基于此，美國科羅拉多大學丹佛分校外科系、南方醫科大學南方醫院心內科的一項聯合研究旨在確定：（1）可溶性ECM蛋白對單核細胞粘附到人AVICs的影響，（2）單核細胞-AVIC相互作用對AVICs對 Matrilin-2 的炎癥反應的影響，（3）單核細胞對AVICs施加影響的機制和（4）負責從單核細胞轉導信息的AVIC信號通路。

單核細胞增強AVICs對可溶性ECM蛋白的炎癥反應

為了確定可溶性ECM蛋白對與THP-1單核細胞共培養的人AVICs炎癥反應的影響，實驗將單培養的AVICs和與THP-1單核細胞共培養的AVICs暴露于增加濃度的Matrilin-2（0，1，2或4 μg/ mL）中48小時。圖1 A顯示，在AVIC 單培養中，Matrilin-2劑量依賴性地增加了ICAM-1和IL-6水平。有趣的是，Matrilin-2在單核細胞-AVIC共培養中誘導了ICAM-1和IL-6水平的更大增加，特別是在暴露于低濃度Matrilin-2（1 μg/mL）的共培養物中。共培養中ICAM-1和IL-6的產生主要由AVICs產生，因為測試濃度中的Matrilin-2對單核細胞中的ICAM-1和IL-6水平沒有影響（圖1 B）。此外，用低濃度的Matrilin-2（1 μg/mL）刺激共培養物以時間依賴性方式增強了AVICs 中 ICAM-1和IL-6的產生，在測試時間點的48小時時效果最大（圖1 C）。這些觀察結果表明，單核細胞增強AVICs對可溶性ECM蛋白的炎癥反應。

圖1   單核細胞-AVIC共培養對Matrilin-2刺激具有更大的炎癥反應。

可溶性ECM蛋白促進單核細胞對AVICs的粘附

接下來檢查了Matrilin-2刺激后單核細胞對AVICs的粘附（圖2 A）。在暴露于Matrilin-2的共培養物中，單核細胞改變了它們的形態（大小和形狀），并對AVICs表現出更大的粘附性。然而，Matrilin-2對單獨培養的單核細胞沒有顯著影響。圖2 B中的免疫熒光圖像證實，共培養中的Matrilin-2刺激改變了單核細胞的形態并增加了它們對AVICs的粘附。這些觀察結果表明，單核細胞在用Matrilin-2刺激時粘附于AVICs上。

圖2   單核細胞在暴露于Matrilin-2的共培養物中粘附于AVICs。

單核細胞通過β2-整合素-ICAM-1相互作用增強AVICs對可溶性ECM蛋白的炎癥反應

為了評估ICAM-1和β2-整合素在介導單核細胞對AVICs的粘附和增強AVICs炎癥反應中的作用，實驗檢查了用中和抗體阻斷ICAM-1和β2-整合素是否可以在暴露于Matrilin-2的共培養中減弱單核細胞粘附并抑制AVIC炎癥反應。結果表明，中和ICAM-1和/或β2-整合素顯著減少了粘附在AVICs上的單核細胞數量。此外，中和ICAM-1或β2-整合素顯著降低了共培養的AVIC中ICAM-1和IL-6的產生，但對暴露于Matrilin-2的單獨培養的AVICs沒有顯著影響。此外，中和β2-整合素和ICAM-1基本上消除了共培養中由Matrilin-2誘導的ICAM-1和IL-6的產生。因此，Matrilin-2誘導單核細胞β2-整合素與AVIC中ICAM-1相互作用，并且這種相互作用導致細胞粘附，增強AVIC對可溶性ECM蛋白的炎癥反應。

YAP和NF-κB參與增強AVIC炎癥反應

為了研究AVIC對可溶性Matrilin-2的炎癥反應增強的信號機制，實驗確定了Matrilin-2對Yes相關蛋白（YAP）和NF-κB的影響，因為它們在介導或調節細胞炎癥反應中起重要作用。圖3 A顯示Matrilin-2在共培養中上調YAP和NF-κB磷酸化。為了評估YAP和NF-kB在調節AVIC炎癥反應中的作用，在共培養之前用特異性YAP抑制劑（verteporfin）或NF-κB抑制劑（Bay 11-7082）預處理AVIC 2小時并暴露于Matrilin-2。抑制AVICs中YAP抑制了共培養中由Matrilin-2誘導的NF-κB磷酸化（圖3 B）。此外，YAP或NF-κB的抑制減弱了共培養中ICAM-1和IL-6的產生（圖3 C、D）。這些結果表明，YAP參與暴露于單核細胞和Matrilin-2的AVICs中的NF-κB激活，并且在這種情況下，YAP和NF-κB都在介導AVICs的炎癥反應中發揮作用。

圖3   Matrilin-2通過激活YAP-NF-κB信號增強共培養中的炎癥反應。

單核細胞β2-整合素通過ICAM-1增強Matrilin-2誘導的AVICs促炎信號和炎癥反應

由于單核細胞對 AVICs 的粘附取決于β2-整合素與ICAM-1，這種分子相互作用似乎是負責增強AVICs炎癥反應的原因，實驗最后測試了重組β2-整合素可以增強AVICs對Matrilin-2的炎癥反應，使用重組的人類CD18蛋白代替表達在單核細胞上的β2-整合素，與Matrilin-2聯合刺激AVICs。雖然單獨使用CD18不會增加人AVICs中ICAM-1和IL-6的產生，或YAP和NF-κB磷酸化，但CD18顯著增強了Matrilin-2誘導的AVICs的ICAM-1和IL-6的AVICs產生，以及YAP和NF-κB的磷酸化。ICAM-1的中和減弱了CD18的增強。ICAM-1中和對炎癥介質產生的這種影響與其抑制暴露于Matrilin-2加CD18的AVIC中YAP和NF-κB的增強磷酸化相關。因此，單核細胞上的β2-整合素通過ICAM-1依賴性機制加劇AVIC炎癥活性，而阻斷 ICAM-1可以抑制這種惡化。

圖4   示意圖總結了單核細胞增強人AVIC對ECM的炎癥反應的潛在機制。單核細胞β2-整合素與AVIC ICAM-1相互作用，通過YAP和NF-κB通路增強AVIC 對可溶性ECM蛋白（可溶性matrilin-2）的炎癥反應。

該研究結果表明，可溶性ECM蛋白誘導單核細胞與AVICs的相互作用，增強AVIC炎癥活性。單核細胞β2-整合素和AVIC ICAM-1的相互作用導致AVICs中YAP和NF-κB的激活，這是對內源性促炎因子的炎癥反應增強的原因（圖4）。這些新發現強調了浸潤單核細胞通過與AVIC的細胞間相互作用在增加主動脈瓣炎癥中的作用，并指出了抑制瓣膜炎癥引起的CAVD進展的潛在靶點。

參考文獻：Luo Z, The E, Zhang P, Zhai Y, Yao Q, Ao L, Zeng Q, Fullerton DA, Meng X. Monocytes augment inflammatory responses in human aortic valve interstitial cells via β2-integrin/ICAM-1-mediated signaling. Inflamm Res. 2022 Jun;71(5-6):681-694. doi: 10.1007/s00011-022-01566Matrilin-2. Epub 2022 Apr 11. PMID: 35411432.

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