動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，優(yōu)先發(fā)生在暴露于擾動血流（d-flow）的動脈分支或彎曲區(qū)域，而穩(wěn)定血流（s-flow）的區(qū)域則受到保護，免受動脈粥樣硬化的影響。內(nèi)皮細胞 （ECs） 在管腔和其表面、細胞-細胞連接處和細胞骨架上配備了幾個機械傳感器，可檢測流體剪切應(yīng)力并觸發(fā)信號通路和細胞反應(yīng)的級聯(lián)。d-流在很大程度上通過調(diào)節(jié)對流動敏感的編碼基因和非編碼基因以及表觀遺傳修飾因子來誘導內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化。使用動脈粥樣硬化和轉(zhuǎn)錄組學研究的部分頸動脈結(jié)扎（PCL）小鼠模型，在ECs中鑒定了數(shù)百個血流敏感基因，與右頸動脈（RCA）中的s-流相比，這些基因通過左頸動脈（LCA）中的d-流而變化。在對流動敏感的基因中，激肽釋放酶10（Klk10）被確定為對血流最敏感的基因之一，在s-流下具有高表達，在d-流下低表達。然而，其在內(nèi)皮功能和動脈粥樣硬化中的作用尚不清楚。

KLK10最初被鑒定為正常的上皮細胞特異性1（NES1）基因，并且是激肽釋放酶相關(guān)肽酶“KLK"家族的成員，該家族由15種分泌絲氨酸蛋白酶組成。KLKs參與各種各樣的過程，從皮膚脫屑到牙齒發(fā)育，高血壓和癌癥。KLK10最初被發(fā)現(xiàn)是一種潛在的腫瘤抑制因子，其在乳腺癌，前列腺癌，睪丸癌和肺癌中的表達下調(diào)。然而，進一步的研究表明，由于KLK10在卵巢癌，胰腺癌和子宮癌中過度表達，因此情況更為復雜。然而，KLK10對內(nèi)皮功能和動脈粥樣硬化的作用尚不清楚。

在美國埃默里大學與佐治亞理工學院庫爾特生物醫(yī)學工程系、中國北京大學生物工程系、英國倫敦帝國理工學院化學系等團隊的一項聯(lián)合研究中，驗證了KLK10介導s-流的抗動脈粥樣硬化作用，而d-流條件下KLK10的損失導致促動脈粥樣硬化生成作用的假設(shè)。

KLK10在體外和體內(nèi)ECs中通過s-流增加，d-流降低

為了驗證KLK10在體內(nèi)表達的血流依賴性調(diào)節(jié)，進行了小鼠PCL手術(shù)以誘導LCA中的d-流，同時維持RCA中的s-流（圖1 a）。與 LCA 的 d-flow相比， ECs 中KLK10的蛋白（圖1 b、c）和mRNA表達（圖1 d）在RCA 的 s-flow 中顯著更高。有趣的是，KLK10蛋白也存在于外膜中，偶爾在內(nèi)皮下層中也觀察到（圖1 b）。此外，KLK10蛋白在較小曲率區(qū)域（LC，自然和長期暴露于d-流的動脈粥樣硬化易發(fā)主動脈弓區(qū)域）與較大曲率區(qū)域（GC，自然和長期暴露于s-流的動脈粥樣硬化保護的主動脈弓區(qū)域）相比，表達降低（圖1 e、f）。

接下來，將人主動脈ECs（HAECs）暴露于單向?qū)恿骷羟校?/span>LS，15 dynes/cm2）或振蕩剪切（OS，±5 dynes/cm2，1 Hz）下24 小時，分別模擬體內(nèi)的 s-流和 d-流條件，測試血流是否可以調(diào)節(jié)KLK10的表達。KLK10 mRNA （圖1 g）、細胞裂解物中的KLK10蛋白（圖1 h、j），以及條件培養(yǎng)基中的分泌蛋白（圖1 j）被OS降低，LS增加，證實了KLK10在體內(nèi)和體外作為流動敏感基因和蛋白質(zhì)的作用。

通過重新分析單細胞 RNA 測序（scRNAseq）和 scATACseq 數(shù)據(jù)集，進一步證實了 Klk10 的流動依賴性表達。如 scRNAseq 數(shù)據(jù)分析（圖1 k），Klk10轉(zhuǎn)錄本表達在s-流中最高，對d-流的反應(yīng)降低。scATACseq 數(shù)據(jù)（圖1 i）表明，Klk10啟動子區(qū)域僅在暴露于s-流條件下的EC中是開放和可訪問的（表明轉(zhuǎn)錄狀態(tài)活躍），但在d-流條件和所有其他非EC類型的EC中是封閉和不可訪問的（表明轉(zhuǎn)錄狀態(tài)不活躍）。這些結(jié)果表明，Klk10表達在表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上受到EC中血流的有效調(diào)節(jié)，支持上述體外和體內(nèi)結(jié)果（圖1 b-g）。

圖1   在體外和體內(nèi)，內(nèi)皮細胞（ECs）中KLK10表達被擾動流（d-flow）抑制，穩(wěn)定流（s-flow）升高。

KLK10抑制內(nèi)皮炎癥并保護通透性屏障

接下來，通過評估KLK10在內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，管形成，遷移，增殖和凋亡中的作用來測試KLK10是否調(diào)節(jié)EC功能，這些作用在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。rKLK10對人臍靜脈ECs（HUVECs）的遷移和管形成可顯著抑制，但不能抑制增殖和凋亡（圖2）。此外，rKLK10以濃度依賴性方式顯著抑制單核細胞對ECs的粘附（圖2 b）。值得注意的是，如果加熱rKLK10，rKLK10的抗炎作用就會喪失，這意味著KLK10的酶活性或天然構(gòu)象的重要性（圖2 b）。此外，rKLK10處理顯著抑制促炎粘附分子VCAM1和ICAM1的mRNA和蛋白質(zhì)表達（圖2 c-g）。

然后，測試了KLK10在體外和體內(nèi)流動條件下對內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的影響。rKLK10 處理抑制 OS 誘導的 HAECs 中的單核細胞粘附（圖2 h）。相反，siRNA介導的KLK10敲低在LS條件下顯著增加了單核細胞的粘附（圖2 i）。接下來測試了rKLK10是否也可以抑制小鼠主動脈弓流動紊亂的LC中的內(nèi)皮炎癥。結(jié)果表明，rKLK10顯著降低了這些小鼠主動脈弓d-流（LC）區(qū)域中VCAM1的表達（圖2 j、k）。這些結(jié)果表明，在TNFα或d-flow條件下，使用質(zhì)粒或rKLK10處理的KLK10過表達在體外和體內(nèi)均可防止EC炎癥，而通過d-flow或KLK10 mRNA敲低來降低KLK10的表達會增加炎癥。

圖2   KLK10在體外和體內(nèi)抑制內(nèi)皮細胞炎癥。

由于NFκB是一種促炎轉(zhuǎn)錄因子，其誘導VCAM1和ICAM1的表達以及隨后單核細胞對ECs的粘附，因此測試了KLK10是否抑制NF-κB活化以響應(yīng)剪切應(yīng)力和TNFα。實驗首先發(fā)現(xiàn)KLK10阻止了磷酸化（p-Ser536）和p65的跨核定位，這是NFκB活化的兩個重要標志物。KLK10還利用LS條件阻止p65的跨核定位以響應(yīng)急性剪切力刺激。

接下來測試了rKLK10處理是否可以保護ECs的滲透性屏障功能。作為陽性對照，凝血酶處理增加了HAECs的滲透性。rKLK10預處理阻止了凝血酶在HAECs中誘導的通透性增加（圖3 a、b）。同樣，rKLK10降低了OS引起的滲透率（圖3 c、d）。這些結(jié)果證明了，KLK10在內(nèi)皮炎癥和屏障功能中的保護作用。

圖3   KLK10保護內(nèi)皮通透性免受凝血酶和振蕩剪切（OS）的影響。

rKLK10處理可抑制Apoe^?/? 小鼠的動脈粥樣硬化

鑒于rKLK10在ECs中的抗炎和屏障保護作用，實驗測試了是否可以通過用rKLK10處理小鼠來預防動脈粥樣硬化的發(fā)展。通過尾靜脈注射rKLK10顯著減少LCA中的動脈粥樣硬化發(fā)展和巨噬細胞積累。rKLK10處理顯示對血漿總膽固醇、LDL（低密度脂蛋白）和HDL（高密度脂蛋白）膽固醇和甘油三酯沒有影響。因此，rKLK10在體內(nèi)顯示出抗動脈粥樣硬化作用。

超聲介導的KLK10過表達抑制Apoe^?/? 小鼠的動脈粥樣硬化

接下來，使用質(zhì)粒載體過表達KLK10是否也可以抑制體內(nèi)動脈粥樣硬化。與對照組相比，KLK10過表達小鼠LCA中動脈粥樣硬化斑塊的形成顯著減少。通過蘇木精和伊紅組織化學染色進一步評估頸動脈切片，顯示這些小鼠LCA中的斑塊面積減少。處死時用ELISA測量的小鼠循環(huán)血漿KLK10水平顯示熒光素酶組和KLK10組之間沒有可測量的差異。這可能是由于處死時質(zhì)粒表達減弱。然而，發(fā)現(xiàn)LCA和RCA的內(nèi)皮層的KLK10染色水平較高，蛋白質(zhì)印跡顯示肺組織樣本中也有KLK10染色。實驗觀察到，血漿總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和非高密度脂蛋白在KLK10注射的小鼠中與對照小鼠相比沒有顯著差異。這些結(jié)果表明，通過rKLK10或KLK10表達載體處理KLK10都可以抑制Apoe^?/? 小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)展。

KLK10在伴有晚期動脈粥樣硬化斑塊的人冠狀動脈中表達降低

最后，實驗檢查了KLK10在具有不同程度動脈粥樣硬化斑塊的人冠狀動脈組織切片中的表達是否改變。KLK10和CD31免疫染色表明，KLK10 表達在斑塊明顯的動脈內(nèi)皮層（4-6級，圖4 a、b），比病變較輕的動脈（1-3級）明顯降低。

圖4   KLK10在具有晚期動脈粥樣硬化斑塊的人冠狀動脈中表達降低。

圖5   對血流敏感的KLK10可抑制內(nèi)皮炎癥并保護通透性屏障，最終減少動脈粥樣硬化。

KL10在基因組和蛋白質(zhì)水平上被s-流上調(diào)，被d-流下調(diào)。在KLK10表達較高的s-流條件下，KLK10抑制NFκB以及血管細胞粘附分子1（VCAM1）和細胞內(nèi)粘附分子1（ICAM1）的表達，從而阻止單核細胞粘附。此外，由 s-flow 產(chǎn)生的 KLK10 可保護內(nèi)皮通透性屏障。總之，KLK10的抗炎和屏障保護作用導致對動脈粥樣硬化的整體保護。

總之，該研究證明了KLK10是一種對流動敏感的蛋白質(zhì)，在ECs中被s-flow上調(diào)，被d-flow下調(diào)。結(jié)果還表明，KLK10是ECs 中s-flow以自分泌方式抗炎、屏障保護和抗動脈粥樣硬化作用的有效中介（圖5）。KLK10可作為潛在的抗動脈粥樣硬化治療靶點。

參考文獻：Williams D, Mahmoud M, Liu R, Andueza A, Kumar S, Kang DW, Zhang J, Tamargo I, Villa-Roel N, Baek KI, Lee H, An Y, Zhang L, Tate EW, Bagchi P, Pohl J, Mosnier LO, Diamandis EP, Mihara K, Hollenberg MD, Dai Z, Jo H. Stable flow-induced expression of KLK10 inhibits endothelial inflammation and atherosclerosis. Elife. 2022 Jan 11;11:e72579. doi: 10.7554/eLife.72579. PMID: 35014606; PMCID: PMC8806187.

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