哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）參與各種細胞功能的調節，并且與心血管疾病（CVDs）的發展密切相關。mTOR是PI3K相關激酶家族中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以形成兩種不同的多蛋白復合物，mTORC1和mTORC2來行使不同的功能。mTORC2參與細胞存活，細胞骨架重塑和細胞遷移的調節。Rictor是mTORC2的核心成分，在調節免疫細胞中發揮重要作用。此外，具有內皮Rictor敲除的小鼠表現出胚胎致死性，并且有條件地敲除內皮Rictor顯著降低了成纖維細胞生長因子誘導的小鼠新生血管形成。然而，關于Rictor對內皮結構或功能的影響的研究通常缺乏。

內皮完整性喪失或內皮功能障礙被認為是心血管疾病的誘發因素，例如高血壓。血管內皮的結構完整性取決于內皮細胞（ECs）之間的細胞連接。粘附連接（AJs）是細胞連接的主要類型。血管內皮鈣粘蛋白（VE-cadherin）是AJs的主要蛋白質成分。

在血管的分支和分叉處，ECs受到振蕩剪切應力或低剪切應力（LSS）的刺激。在這里，內皮穩態不平衡，容易發生動脈粥樣硬化。相反，在直血管區域，觀察到單向血流，生理剪切應力（PSS）對血管內皮具有保護作用。然而，在剪切應力條件下，Rictor在內皮完整性和血管內皮鈣粘蛋白表達中的作用缺乏研究。

血管性血友病因子（VWF）是內皮穩態的另一個關鍵標志物。mTOR激酶抑制劑可以在不影響細胞內VWF分泌的情況下抑制血栓形成。然而，尚未報道VWF和Rictor在內皮損傷中的關系。

在南京醫科大學第一附屬醫院心血管內科、南京醫科大學附屬江寧醫院重癥科的一項研究中，驗證了Rictor在生理穩態下對內皮完整性的影響，以及LSS誘導的血管內皮損傷下對VE-鈣粘蛋白和VWF表達的影響。

Rictor 缺失破壞了層流區域的內皮完整性

在成功生成內皮Rictor缺失小鼠模型后，實驗選擇了Rictor^fl/fl 和 Rictor^iΔEC  小鼠胸主動脈檢測內皮形態，其中內皮細胞暴露于PSS（15 dyn/cm2）。結果顯示，Rictor缺失后內皮完整性受損（圖1）。以上結果表明，內皮Rictor缺失可導致內皮完整性喪失。

圖1   Rictor 缺失破壞了胸主動脈區域的內皮完整性。

圖像顯示Rictor^fl/fl （上）和 Rictor^iΔEC  （下）小鼠胸主動脈內皮的形態。從左到右的紅色框區域是局部放大區域，黑色箭頭表示流向。

Rictor 缺失破壞了左頸總動脈區域的內皮完整性并擴大了細胞連接

為了在體內病理狀態下模擬LSS（2 dyn/cm2），在小鼠中部分結扎左頸總動脈（LCA），右頸總動脈（RCA）未結扎。結果顯示，LCA血管內皮受損，Rictor^iΔEC 小鼠表現出更明顯的內皮形態損傷。此外，LSS刺激使細胞連接變寬，Rictor^iΔEC 小鼠的LCA細胞連接間隙更明顯。以上結果表明，Rictor的缺失參與了LSS引起的血管內皮損傷的病理過程。

Rictor 缺失促進應力纖維形成

接下來探討了Rictor缺失加重LSS誘導的血管內皮形態損傷的機制。F-肌動蛋白是內皮細胞連接復合物的重要組成部分。F-肌動蛋白以完整和連續的形式位于細胞膜的外圍，并與 VE-鈣粘蛋白復合物結合形成線性 AJs 以維持內皮屏障功能。

實驗在體外模擬了平行板流動室系統中不同類型剪切應力對HUVECs的刺激。結果顯示，在PSS條件下，F-肌動蛋白主要均勻分布在細胞周圍。用LSS刺激HUVECs 1h后，F-肌動蛋白的極性受到干擾。觀察到明顯的應力纖維形成。在LSS條件下沉默Rictor后觀察到增強的應力纖維形成（圖2 A、B）。這一發現表明，Rictor對細胞骨架蛋白的排列很重要，表明Rictor可能通過調節F-肌動蛋白的分布和排列參與LSS誘導的ECs的形態變化。

圖2   Rictor參與了剪切應力下細胞骨架的排列。

（A）免疫熒光圖像顯示了由LSS刺激和有或沒有Rictor siRNA轉染的肌動蛋白絲（F-肌動蛋白）的極性。（B）測量F-肌動蛋白的平均熒光強度。

低剪切應力引起的粘附連接斷裂

內皮 AJs 在維持內皮完整性方面起著關鍵作用。在體外，觀察到AJs的主要蛋白VE-鈣粘蛋白的表達和定位。在PSS刺激下，VE-鈣粘蛋白主要位于細胞膜上，細胞連接處染色清晰光滑。然而，在LSS刺激下，VE-鈣粘蛋白部分轉移到細胞質中，細胞連接處的鋸齒狀減小。此外，細胞間隙明顯形成（圖3 A）。通過免疫印跡檢測HUVECs中的VE-鈣粘蛋白表達。LSS導致VE-鈣粘蛋白膜蛋白表達降低（圖3 C），而總蛋白表達不變（圖3 B）。上述結果表明，在LSS暴露期間，VE-鈣粘蛋白在AJs的穩定性降低，隨后VE-鈣粘蛋白易位。

圖3   LSS促進了VE-鈣粘蛋白的易位。

（A）免疫熒光顯示VE-鈣粘蛋白在不同類型剪切應力下的定位。VE-鈣粘蛋白在LSS刺激后在膜上的定位較少。右圖顯示了細胞間隙的定量。（B）在不同類型的剪切應力下檢測總VE-鈣粘蛋白表達。（C）在不同類型的剪切應力下檢測細胞膜上VE-鈣粘蛋白的表達。

下調Rictor降低低剪切應力刺激下血管內皮-鈣粘蛋白表達及其膜定位

接下來，Rictor是否通過VE-鈣粘蛋白影響ECs的完整性。在體外驗證Rictor siRNA的轉染效率。用Rictor siRNA轉染HUVECs，然后用PSS或LSS刺激1小時。免疫印跡顯示，在LSS刺激下，下調Rictor抑制VE-鈣粘蛋白表達。在體內，Rictor^iΔEC小鼠的LCA中總VE-鈣粘蛋白和VE-鈣粘蛋白在細胞膜上的定位降低。以上結果表明，Rictor缺失加劇了LSS刺激的HUVECs中VE-鈣粘蛋白的內化和重塑以及F-肌動蛋白，這是導致內皮形態損傷的重要機制。

低剪切應力促進內皮細胞中血管性血友病因子的表達

VWF是另一種調節血管內皮穩態的關鍵蛋白，其表達在不同剪切應力刺激下發生變化。在體內，與Rictor^fl/fl 小鼠的RCA相比，VWF在LCA中上調。在體外，LSS刺激后VWF顯著上調。上述數據表明，LSS上調了VWF表達。

下調Rictor抑制低剪切應力誘導的血管性血友病因子表達

接下來探討了Rictor在LSS誘導的VWF表達中的作用。結果顯示，下調Rictor抑制LSS誘導的VWF表達。在體外，siRNA用于沉默Rictor，免疫印跡顯示下調Rictor抑制LSS誘導的VWF蛋白表達。結果表明，Rictor介導了LSS誘導的VWF表達。

血管內皮鈣粘蛋白下調降低了低剪切應力促進的血管性血友病因子表達

為了探索VE-鈣粘蛋白對LSS刺激下VWF表達的影響，實驗首先使用了免疫印跡（圖4 A）和 PCR （圖4 B）檢測以驗證CDH5（VE-鈣粘蛋白的基因名稱）的三個siRNA序列，并選擇具有最佳敲低效果的序列進行后續實驗。免疫印跡和IF檢測顯示，LSS刺激誘導的VWF表達上調依賴于VE-鈣粘蛋白（圖4 C、D）。這些結果表明，LSS至少部分通過VE-鈣粘蛋白調節VWF，并表明Rictor/VE-鈣粘蛋白/VWF通路介導LSS誘導的內皮完整性破壞。

圖4    VE-鈣粘蛋白的下調降低了VWF表達。

（A）代表性圖像顯示VE-鈣粘蛋白（CDH5）的敲低。C和NC分別代表對照組和陰性對照組。（B）PCR檢測CDH5敲低效率。（C）VWF蛋白的表達是在不同類型的剪切應力和有或沒有siCDH5 siRNA轉染下通過免疫印跡檢測的。（D）免疫熒光圖像顯示VE-鈣粘蛋白下調降低了VWF表達。

總之，該研究報道了Rictor在LSS下通過調節內皮AJs和VWF在維持血管內皮完整性和介導內皮損傷方面發揮作用。此外，Rictor同時影響PSS和LSS下的AJs和VWF蛋白，表明它可能是一種機械傳感器，它的存在在機械轉導過程中起著重要作用。

參考文獻：Li H, Zhou WY, Liu YX, Xia YY, Xia CL, Pan DR, Li Z, Shi Y, Chen SL, Zhang JX. Rictor maintains endothelial integrity under shear stress. Front Cell Dev Biol. 2022 Nov 10;10:963866. doi: 10.3389/fcell.2022.963866. PMID: 36438564; PMCID: PMC9685313.

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