骨質(zhì)疏松癥是一種全身性代謝性骨病，其特征是骨髓間隙中的骨形成減少，導(dǎo)致骨量丟失和微觀(guān)結(jié)構(gòu)退變。據(jù)估計(jì)，骨質(zhì)疏松癥每年導(dǎo)致全球超過(guò)900萬(wàn)例骨折。因此，迫切需要替代骨質(zhì)疏松癥的治療方法，特別是能夠抵消骨量流失的療法，這對(duì)于老年人群至關(guān)重要。

人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）由于其多能性，是骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)的細(xì)胞療法的理想選擇。在機(jī)械或化學(xué)刺激下，可以誘導(dǎo)hMSCs分化為各種譜系，包括成骨細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。此外，hMSCs的分化受到局部機(jī)械和化學(xué)環(huán)境的密切控制，從而在成骨分化和脂肪分化之間保持平衡。成骨分化減少和脂肪分化增加可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。研究已經(jīng)鑒定出許多化學(xué)刺激（例如，小的生物活性分子，生長(zhǎng)因子和遺傳調(diào)節(jié)因子）來(lái)調(diào)節(jié)hMSCs譜系，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP），Wnt和Notch信號(hào)。

成骨分化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，涉及幾種重要的信號(hào)通路，包括YAP / TAZ（具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子），Notch和RhoA信號(hào)通路。研究表明，流體剪切力調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的體外成骨分化。盡管目前的研究表明剪切應(yīng)力可以增強(qiáng)成骨分化，但由于缺乏有效的工具來(lái)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的基因表達(dá)，Notch信號(hào)在剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨中的參與尚不清楚。

在美國(guó)紐黑文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系、利哈伊大學(xué)生物工程系、杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系、康涅狄格大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，利用雙鏈鎖核酸/DNA（LNA/DNA）納米生物傳感器闡明了Notch信號(hào)在暴露于生理相關(guān)剪切應(yīng)力（3-7 dynes/cm2）的hMSCs的成骨分化過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果將為剪切應(yīng)力下hMSCs的成骨分化和Notch信號(hào)的參與提供新的信息。

流體剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和活力

為了研究不同水平的剪切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞增殖和活力的影響，設(shè)計(jì)并比較了3組實(shí)驗(yàn)：靜態(tài)組，6 h剪切力刺激組和不間斷剪切力刺激組。實(shí)驗(yàn)研究了兩種不同水平的剪切應(yīng)力：低流體剪切應(yīng)力（1–9 dynes/cm2）和高流體剪切應(yīng)力（9–20 dynes/cm2），分別在第3天和5天后評(píng)估細(xì)胞活力和增殖。

圖1 A顯示了不同組別下hMSCs在剪切應(yīng)力下5 d后的熒光圖像。當(dāng)hMSCs暴露于連續(xù)剪切力5天時(shí)，死細(xì)胞的數(shù)量增加。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步量化了剪切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞活力和增殖的影響。施用剪切3 d后，剪切應(yīng)力下hMSCs的細(xì)胞活力和增殖與靜態(tài)條件下的hMSCs相比沒(méi)有顯著差異（圖1 B、C 左）。5 天后，連續(xù)剪切應(yīng)力下的 hMSCs 細(xì)胞活力和增殖顯著降低，與靜態(tài)條件下的細(xì)胞相比，細(xì)胞活力降低 21.5%，增殖減少19.8%（圖1 B、C 右）。此外，在每天6 h施加剪切應(yīng)力5天后，hMSCs的細(xì)胞活力和增殖與靜態(tài)狀態(tài)的hMSCs相比沒(méi)有顯著差異。

此外，還研究了高流體剪切應(yīng)力（9-20 dynes/cm2）對(duì)hMSCs的活力和增殖的影響。暴露于高剪切應(yīng)力3天的hMSCs，不間斷剪切應(yīng)力組的細(xì)胞活力降低了55%。5 d后，6 h刺激組和不間斷刺激組的死細(xì)胞數(shù)量均顯著增加。此外，與靜態(tài)的hMSCs相比，細(xì)胞活力分別降低了14.8%和19.2%。高流體剪切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞增殖的影響具有類(lèi)似的影響。

這些結(jié)果表明，剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和活力與時(shí)間和速度有關(guān)。在高流體剪切應(yīng)力下，細(xì)胞活力和增殖降低。在低流體剪切應(yīng)力下，當(dāng)細(xì)胞暴露于周期性剪切（6h 剪切/天）而不是連續(xù)剪切（不間斷剪切）時(shí)，其活力和增殖不受影響。總之，對(duì)于低流體剪切應(yīng)力下的hMSCs，每天6小時(shí)，持續(xù)5天，與靜態(tài)條件相比，細(xì)胞活力和增殖沒(méi)有顯著差異。因此，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)選擇了3-7 dynes/cm2，以避免剪切應(yīng)力對(duì)其余研究的細(xì)胞活力和增殖的影響。

圖1   剪切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞活力和增殖的影響。

低流體剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)

為了研究低流體剪切應(yīng)力對(duì)hMSCs形態(tài)的影響，實(shí)驗(yàn)量化并比較了細(xì)胞表型行為，包括在有（3-7 dyne/cm2，6h）和沒(méi)有剪切應(yīng)力下的細(xì)胞面積，細(xì)胞長(zhǎng)度，細(xì)胞長(zhǎng)寬比以及細(xì)胞周長(zhǎng)。

圖2 A、B顯示了hMSCs在靜態(tài)條件下（圖2 A）和暴露于剪切應(yīng)力下（圖2 B）的熒光圖像。3天后，與靜態(tài)條件下培養(yǎng)的hMSCs相比，在剪切應(yīng)力下培養(yǎng)的hMSCs的細(xì)胞面積、長(zhǎng)寬比、周長(zhǎng)和細(xì)胞長(zhǎng)度略有增加（細(xì)胞面積增加16.3%，細(xì)胞長(zhǎng)寬比增加14.9%，周長(zhǎng)增加18%，細(xì)胞長(zhǎng)度增加12%）。然而，與在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的hMSCs相比，暴露于低流體剪切應(yīng)力5天的hMSCs分別顯示出細(xì)胞面積增加55%，細(xì)胞長(zhǎng)度增加72%，細(xì)胞長(zhǎng)寬比增加16%和細(xì)胞周長(zhǎng)增加30%（圖2 C、D）。這些結(jié)果表明，hMSCs對(duì)低流體剪切應(yīng)力敏感，形態(tài)變化顯著。

圖2   剪切應(yīng)力對(duì)hMSCs形態(tài)變化的影響。

低流體剪切應(yīng)力促進(jìn)成骨分化

通過(guò)施加剪切力（3-7 dyne/cm2），進(jìn)一步闡明了低流體剪切應(yīng)力對(duì)成骨分化的影響，在成骨誘導(dǎo)和剪切刺激5天后，通過(guò)測(cè)量ALP酶活性來(lái)評(píng)估和比較成骨分化，ALP酶活性是早期成骨分化的可靠生化標(biāo)志物。

圖3 A、B分別顯示了靜態(tài)和剪切應(yīng)力下hMSCs的熒光圖像。在剪切應(yīng)力下，當(dāng)誘導(dǎo)hMSCs進(jìn)行成骨分化時(shí)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生顯著改變。結(jié)果表明，在沒(méi)有成骨誘導(dǎo)的情況下，綠色熒光信號(hào)最小，表明ALP酶活性最小。隨著成骨誘導(dǎo)，在靜態(tài)和剪切應(yīng)力下，hMSCs的ALP酶活性顯著提高。在靜態(tài)條件下，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hMSCs的ALP活性比在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hMSCs提高了1.8倍。在低流體剪切應(yīng)力下，ALP活性提高了2.1倍。此外，與靜態(tài)條件相比，暴露于剪切應(yīng)力的hMSCs在成骨誘導(dǎo)后ALP活性增加了15%（圖3 C）。此外，在低流體剪切應(yīng)力下，hMSCs分化率提高到45.51%，而靜態(tài)條件下hMSCs分化率為38.02%（圖3 D）。這些結(jié)果表明，低流體剪切應(yīng)力顯著增強(qiáng)了成骨分化，ALP酶活性和成骨分化率增加。

圖3   剪切應(yīng)力增強(qiáng)hMSCs成骨分化。

Notch信號(hào)參與剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化

先前的研究表明，Notch信號(hào)參與hMSCs成骨分化過(guò)程，介導(dǎo)的ALP活性以及成骨分化率。然而，低流體剪切應(yīng)力是否通過(guò)Notch信號(hào)調(diào)節(jié)hMSCs的成骨分化尚不清楚。為了更好地了解Notch信號(hào)在成骨分化過(guò)程中的參與，利用藥物DAPT（Notch信號(hào)抑制劑）來(lái)擾亂Notch信號(hào)傳導(dǎo)。hMSCs在有或沒(méi)有剪切應(yīng)力下的成骨分化過(guò)程中用濃度為20 μM的DAPT處理，以觀(guān)察潛在的相關(guān)影響。

圖4 A、B顯示了hMSCs在靜態(tài)條件和剪切應(yīng)力下在基礎(chǔ)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基和加DAPT處理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的代表性圖像。結(jié)果表明，使用DAPT抑制Notch信號(hào)在靜態(tài)條件和剪切應(yīng)力下介導(dǎo)了成骨分化。特別是在靜態(tài)條件下，隨著DAPT的處理，成骨誘導(dǎo)5 d后的ALP酶活性降低了28.8%。同時(shí)，暴露于低流體剪切應(yīng)力的hMSCs，誘導(dǎo)5 d后的ALP酶活性在DAPT處理下降低了18.2%。有趣的是，剪切應(yīng)力下hMSCs的DAPT處理對(duì)成骨分化的影響較小，表明低流體剪切應(yīng)力挽救了藥物處理引起的Notch信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用。

為了進(jìn)一步研究在低流體剪切應(yīng)力下成骨分化過(guò)程中Notch信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)利用LNA/DNA納米生物傳感器在基礎(chǔ)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基和DAPT處理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中檢查了靜態(tài)和剪切力條件下的Notch 1配體，Dll4 mRNA的表達(dá)。圖4 A、B顯示了不同處理下靜態(tài)和剪應(yīng)力下hMSCs的代表性圖像。在靜態(tài)條件下，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的hMSCs顯示出Dll4 mRNA的表達(dá)顯著增加。DAPT處理后，與成骨誘導(dǎo)組相比，Dll4 mRNA顯著降低（圖4 D）。當(dāng)暴露于低流體剪切應(yīng)力時(shí)，成骨誘導(dǎo)組hMSCs的Dll4 mRNA表達(dá)比在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hMSCs增加了2.72倍。DAPT的處理抑制成骨分化約50%（圖4 D）。與靜態(tài)相比，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)hMSCs時(shí)，Dll4 mRNA表達(dá)提高了22.8%。DAPT處理介導(dǎo)剪切應(yīng)力對(duì)成骨分化的影響，Dll4 mRNA表達(dá)僅增加約16%。

這些結(jié)果證明，Notch信號(hào)參與并調(diào)節(jié)了低流體剪切應(yīng)力下hMSCs的成骨分化。低流體剪切應(yīng)力上調(diào)成骨誘導(dǎo)下hMSCs的Dll4 mRNA表達(dá)，表明Notch信號(hào)參與機(jī)械調(diào)節(jié)的成骨分化。Notch信號(hào)的抑制介導(dǎo)了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化的影響，ALP酶活性降低，Dll4 mRNA表達(dá)降低。

圖4   Notch信號(hào)在有和無(wú)剪切應(yīng)力情況下調(diào)節(jié)hMSCs的成骨分化。

在這項(xiàng)研究中，利用LNA/DNA納米生物傳感器在暴露于生理相關(guān)的低流體剪切應(yīng)力的hMSCs的成骨分化過(guò)程中檢測(cè)Dll4 mRNA基因表達(dá)譜。研究結(jié)果證明，Notch信號(hào)調(diào)節(jié)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化，表明Notch信號(hào)在成骨分化中的機(jī)械敏感性作用。進(jìn)一步的研究可能闡明Notch信號(hào)在調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化中的機(jī)械敏感作用的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Zhao Y, Richardson K, Yang R, Bousraou Z, Lee YK, Fasciano S, Wang S. Notch signaling and fluid shear stress in regulating osteogenic differentiation. Front Bioeng Biotechnol. 2022 Oct 5;10:1007430. doi: 10.3389/fbioe.2022.1007430. PMID: 36277376; PMCID: PMC9581166.

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