由于其成骨誘導的特性，基于干細胞的骨再生療法有望改善臨床中的骨愈合。誘導多能干細胞（iPSCs）具有無限的增殖能力，可以作為體外組織工程的干細胞庫。此外，iPSCs具有多能性和自組織潛力，可以分化成三個胚層（內胚層、中胚層、外胚層），并且可以在不使用支架的情況下形成三維（3D）組織或器官。因此，iPSCs可能是骨組織工程的一個有希望的來源。但iPSCs的成骨分化需要更大的刺激來引導足夠的iPSC分化為成骨細胞。

機械刺激，特別是那些來自剪切力、壓縮力和拉伸力的刺激，在胚胎發生/器官發生過程中發揮作用。先前的研究表明，剪切應力以不同的方式增強了間充質基質細胞、成骨細胞和骨細胞的成骨分化，這取決于施加的剪切力的大小、持續時間和頻率。然而，對這種現象背后的機制知之甚少。

類器官技術的趨勢，以及再生醫學骨組織工程的趨勢，依賴于iPSC自組織，這仍然需要一個強大的成骨分化因素。剪切力已被廣泛研究用于干細胞/骨細胞的成骨分化。盡管剪切應力對改善骨組織工程很有吸引力，但其對iPSCs成骨分化的影響尚不清楚。

因此，日本東北大學牙科研究生院、泰國朱拉隆功大學牙科學院等研究團隊假設特定的剪切應力可以增強小鼠iPSC成骨分化。為了驗證這一假設，使用剪切應力加載裝置在成骨誘導下將剪切應力施加到附著型胚狀體（EB）培養物上，使細胞承受連續的剪切力。

連續剪切應力對小鼠iPSC活力、增殖和多能性的影響

小鼠牙齦來源的 iPSCs進行成骨誘導，用三種不同程度的剪切應力（0.15、0.5和1.5 Pa）應用于粘附的iPSCs。

結果發現，測試的幅度沒有明顯影響細胞活力。1天后，與生長培養基（ES培養基）相比，細胞增殖顯著減少。將細胞在靜態條件下再維持兩天后，成骨誘導培養基中的細胞數明顯低于ES培養基中的細胞數。第3天，在剪切應力（0.15、0.5和1.5 Pa）下，細胞數顯著低于靜態組，且呈力依賴性下降。施加剪切應力2 天后，Oct3/4、Sox2和Nanog的基因表達略有增加，而Klf4表達以力依賴性方式略有下降。剪切應力加載組中Nanog和Oct4的蛋白表達增加。0.5和1.5 Pa剪切力加載組的Klf4蛋白表達量下降，而在0.15 Pa的剪切應力加載下，Klf4表達量略有增加。

連續剪切應力對小鼠iPSCs成骨分化的影響

實驗探討了不同剪切力大小對成骨表達的影響。實時熒光定量PCR分析顯示，在剪切應力作用下，osterix蛋白（Osx）、骨鈣素（Ocn）和骨橋蛋白（Opn）均顯著上調。OCN表達在0.5 Pa組中最高（圖1 A）。相對于靜態組，膠原蛋白1a1（Col1a1）表達僅在0.5 Pa組中顯著增加。與靜態組相比，Runx2的表達水平在0.15和1.5 Pa組中受到抑制，但在0.5 Pa組中未被抑制（圖1 A）。成骨相關蛋白Osx、Col1a1和Opn在剪切應力應用組中的表達高于靜態組（圖1 B）。在所有組的EB區均觀察到陽性茜素紅S（ARS）染色（圖1 C）。相反，在剪切應力加載組中觀察到細胞生長區域的陽性染色（圖1 C）。ARS染色的定量顯示，相對于靜態組，礦化度顯著增加，在0.5 Pa組中觀察到最高的礦化度（圖1 D）。

圖1   連續剪切應力以與力無關的方式增強了iPSCs的成骨分化

剪切應力持續時間對小鼠iPSCs成骨分化的影響

在施加剪切應力24 h后，Osx和Ocn上調（圖2 A）。暴露48小時后，Osx表達相對于靜態組的倍數變化進一步增加。在剪切應力12 h后，Col1a1和Opn顯著上調，后者在24 h和48 h分別進一步增加到3倍和7倍，而Col1a1表達的倍數變化在所有時間點都保持在2–2.5倍（圖2 A）。靜態組在12和24小時未發現陽性染色。相反，在0.5 Pa組的生長細胞區域中觀察到陽性ARS染色（圖2 B）。ARS定量顯示，48 h內0.5 Pa組的礦物沉積量明顯高于靜態組（圖2 C）。在施加剪切應力（0.5 Pa）48 h后，Osx的表達和核定位增強（圖2 D、E）。相對于靜態組，Opn蛋白在0.5 Pa組中的表達更高（圖2 F、G）。

圖2   連續剪切應力以時間依賴性方式增強了iPSCs的成骨分化

評估0.5Pa下的成骨分化；在施加0.5 Pa剪切應力12、24和48小時之前，iPSCs在OS培養基中維持1天，在同一時間點收集OS培養基中的對照靜態培養物進行評估。

連接蛋白43（Cx43）和Trpm7參與剪切應力誘導的小鼠iPSCs成骨分化

研究表明，剪切應力通過p38和Erk1/2通路調控細胞表面通道Trpm7和Cx43，增強了小鼠間充質干細胞和人PDLCs的成骨分化。施加剪切應力2天后，與靜態組相比，0.15、0.5和1.5 Pa剪切應力組中Tprm7、Cx43、磷酸化-Erk1/2和磷酸化-p38蛋白的表達增強（圖3 A）。此外，在0.5 Pa組中觀察到最高的Cx43表達（圖3 A）。蛋白質印跡分析顯示，0.5 Pa組中的Cx43和磷酸化-Erk1/2表達顯著更高（圖3 B）。在靜態組中觀察到細胞核周圍的Cx43表達，而在細胞膜周圍觀察到0.5 Pa組中的Cx43表達更高（圖3 C、E）。剪切應力（0.5 Pa）增強了細胞細胞質中Erk1/2的磷酸化（圖3 D、E）。靜態組中的Trpm7表達主要在細胞核周圍檢測到，而0.5 Pa組中在整個細胞中觀察到Trpm7通道表達（圖3 F）。

圖3   連續剪切應力增強iPSCs成骨分化的機制。在承受剪切應力48小時后分析iPSCs

Erk1/2信號通路參與剪切應力誘導的小鼠iPSCs成骨分化

細胞毒性測定顯示，用1μM和10μM SCH772984（一種Erk1/2磷酸化抑制劑）處理沒有顯著差異。較高的濃度（20、30、40 和 50 μM）導致細胞活力顯著降低（圖4 A）。在靜態和0.5 Pa組中以及用1 μM和10 μM SCH772984處理組中觀察到細胞形態不均勻（圖4 B）。在靜態培養組中，用1μM SCH772984處理24小時不影響成骨標志基因（Osx和Ocn）表達。然而，用10μM SCH772984處理后，只有Osx基因表達顯著降低。相反，在施加剪切應力（0.5 Pa）24 h后，Osx、Ocn和Opn上調。此外，抑制劑處理組的上調受到顯著抑制（圖4 C）。在施加剪切應力一天后，在ARS染色之前將細胞在靜態條件下再維持5天。在剪切應力組的生長單元區域觀察到增強的礦物沉積（圖4 D）。用10μM SCH772984處理可抑制剪切應力施加過程中的礦物沉積。茜素紅S的定量分析顯示，與靜態組相比，剪切應力應用組的礦物沉積顯著增強（圖4 E）。抑制劑處理組和靜態處理組之間未觀察到顯著差異。

圖4     抑制Erk1/2活性抑制了剪切應力增強的iPSCs的成骨分化

圖5   剪切應力增強小鼠iPSCs成骨分化及相關機制示意圖

剪切應力通過連接蛋白43（Cx43）和Erk1/2信號通路增強小鼠iPSCs的成骨分化。Erk1/2活性的抑制部分抑制了成骨基因的表達。Trpm7表達和下游磷酸化-p38在剪切應力下上調，這意味著它們可能參與了剪切應力增強iPSCs的成骨分化。

總之，該研究發現剪切應力增強了小鼠iPSCs的成骨分化，部分是通過Cx43和下游Erk1 / 2信號通路。此外，0.5 Pa將是誘導小鼠iPSC向成骨細胞分化的最佳剪切力大小。

參考文獻：Limraksasin P, Nattasit P, Manokawinchoke J, Tiskratok W, Vinaikosol N, Okawa H, Limjeerajarus CN, Limjeerajarus N, Pavasant P, Osathanon T, Egusa H. Application of shear stress for enhanced osteogenic differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2022 Nov 8;12(1):19021. doi: 10.1038/s41598-022-21479-8. PMID: 36347883.

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