動脈粥樣硬化是一種大動脈疾病，其發病機制的起始步驟是血管內皮屏障功能障礙。覆蓋在內皮細胞表面的糖萼是維持內皮和血管功能的非常關鍵的“器官"。越來越多的證據表明，內皮糖萼不完整性導致血管系統對致動脈粥樣硬化和炎癥的敏感性增加。作為糖萼的主要成分，透明質酸（HA）可以微調細胞行為，能監測和放大內皮細胞膜上的流動引起的剪切應力。

活性氧（ROS）不僅對糖萼構成直接威脅，而且還可以通過激活基質金屬蛋白酶（MMPs）和內源性蛋白酶抑制劑的失活來增強糖萼的蛋白水解，可以降解膠原蛋白，透明質酸和層粘連蛋白，所有這些都是細胞外基質（ECM）的主要組成部分，導致糖萼層的根本破壞。

低剪切應力（LSS）會導致活性氧的產生過多，超過系統的局部抗氧化能力，進而導致糖萼降解。顯然，低剪切應力刺激和氧化應激之間存在惡性循環，兩者協同作用可能會使糖萼退化。但是，低剪切應力誘導的內皮功能障礙的發病機制在很大程度上仍不清楚。

小檗堿（BBR）也叫黃連素，是從中藥黃連中分離出來的一種生物堿，具有多種藥理和生物學活性，例如抗菌活性、抗炎、抗氧化應激和心臟保護作用。先前的研究表明，低剪切應力通過增加p47 ^phox的磷酸化以及增加的活性氧產生來損害糖萼。然而，低剪切應力誘導的糖萼降解和小檗堿之間的相互作用，以及小檗堿對低剪切應力損傷的內皮的保護作用的機制，仍然未知。

因此，江蘇大學附屬醫院重癥醫學科、南京醫科大學第一附屬醫院心血管內科、揚州大學附屬醫院心血管內科的一項聯合研究旨在探索小檗堿是否減弱了細胞和動物模型中低剪切應力誘導的糖萼降解，并闡明了潛在的分子機制。

小檗堿改善低剪切應力誘導的透明質酸降解

低剪切應力可以促進透明質酸的降解，其降解可以促進炎癥反應。相反，小檗堿已被證明在抑制炎癥方面起著關鍵作用。因此，實驗決定確定小檗堿是否參與透明質酸代謝的調節。首先，將HUVECs暴露在設置的時間（0、5、15、30、60和120 min）的低剪切應力（2?dyne/cm2）下。免疫熒光分析顯示，透明質酸表達明顯降低，在暴露于低剪切應力30 min時達到最小值（圖1）。其次，用不同劑量（0、5 μmol/l、10 μmol/l和20 μmol/l）對HUVECs進行預處理24 h，然后暴露于低剪切應力下，結果表明，小檗堿降低了低剪切應力誘導的透明質酸降解，且呈濃度依賴性（圖1 B）。

為了確定小檗堿降低體外透明質酸降解的作用是否可以轉化到小鼠模型，通過免疫熒光測量了透明質酸的表達并量化了IHC載玻片。結果表明，與對照組相比，小檗堿處理顯著恢復了主動脈血管組織中透明質酸的表達（圖1 C、D）。

圖1   小檗堿改善低剪切應力誘導的HA降解

小檗堿抑制低剪切應力誘導的NADPH氧化酶激活

作為活性氧的主要來源，NADPH-氧化酶在血管細胞糖萼的代謝中起著至關重要的作用。以前的研究表明，低剪切應力和小檗堿對NADPH氧化酶的活性具有相反的影響，其中低剪切應力誘導NADPH氧化酶激活，而小檗堿抑制NADPH氧化酶活化。在這項研究中，證實了低剪切應力可以提高p47phox的磷酸化水平并在體外激活NADPH 氧化酶 2（NOX2）。此外，還顯示低剪切應力下內皮細胞中p47phox的磷酸化水平顯著高于靜態組。免疫共沉淀分析表明，低剪切應力增加了p47phox和NOX2的結合，這可能導致NADPH氧化酶的活化。然而，用小檗堿預處理后，p47phox磷酸化和NOX2活化都受到抑制，p47phox和NOX2的結合也在體外降低，伴隨著活性氧產生的減少。

有趣的是，小檗堿處理導致p47phox 的基礎磷酸化水平升高，但與對照組相比，當暴露于低剪切應力時，這種變化沒有進一步增加。小檗堿處理組和對照組的活性氧和NO的基礎水平都沒有明顯變化。同樣，小檗堿不僅不增加細胞凋亡，而且還減少低剪切應力誘導的細胞凋亡。

小檗堿抑制LSS誘導的Hyal2激活并調節p47phox和 Hyal2的串擾

作為調節HA代謝的主要酶，透明質酸氨基葡糖苷酶2（Hyal2）在HA消化中起著至關重要的作用。體外蛋白質印跡和免疫熒光均顯示，暴露于低剪切應力后，Hyal2表達顯著增加（圖2 B、E）。為了確定小檗堿是否也與Hyal2的激活有關，用小檗堿（5μM、10μM、20μM）預處理細胞24小時，然后暴露于低剪切應力。蛋白質印跡顯示，小檗堿抑制Hyal2活化（圖2 C、D），免疫熒光分析也證明小檗堿可以降低Hyal2表達（圖2 E）。與p47phox磷酸化的變化類似，體內小檗堿預處理后Hyal2表達也降低（圖2 A）。

此外，發現p47phox沉默后，小檗堿未能進一步抑制低剪切應力誘導的Hyal2激活，表明小檗堿通過調節p47phox抑制Hyal2的活性。同樣，當 p47phox過表達時，小檗堿不能有效抑制Hyal2活化；當Hyal2沉默時，小檗堿也不能抑制低剪切應力誘導的 p47phox 磷酸化。此外，發現小檗堿可以增加p47phox/Hyal2 的結合。

圖2   小檗堿抑制LSS誘導的Hyal2激活

小檗堿逆轉低剪切應力誘導的AMPK去磷酸化

研究表明，小檗堿對糖尿病和肥胖癥有益，至少部分是通過調節AMPK活性。因此，假設小檗堿可能會逆轉低剪切應力誘導的AMPK磷酸化水平降低。圖3 A表明，低剪切應力降低了AMPK的磷酸化水平。用小檗堿預處理后，可以逆轉低剪切應力誘導的AMPK去磷酸化（圖3 C）。為了證明小檗堿激活AMPK的功效，用不同濃度的小檗堿（5μM、10μM、20μM）預處理HUVECs 24小時，然后暴露于低剪切應力。蛋白質印跡顯示，小檗堿可以以劑量依賴性方式顯著增加AMPK的磷酸化水平（圖3 B）。

圖3   小檗堿通過逆轉低剪切應力誘導的 AMPK 抑制抑制p47phox和 Hyal2 激活

小檗堿通過AMPK活化抑制HUVECs中p47phox 磷酸化和Hyal2活化

考慮到小檗堿恢復了低剪切應力誘導的AMPK去磷酸化，實驗試圖確定小檗堿是否通過激活 AMPK減弱低剪切應力誘導的p47phox磷酸化和 Hyal2 活化。結果表明，在與小檗堿和化合物C（AMPK抑制劑）共同處理后，低剪切應力可以消除p47phox和Hyal2對小檗堿的響應（圖3 D）。為了進一步在小檗堿處理中連接 AMPK 與 p47phox和Hyal2，通過敲低AMPKα1，然后用小檗堿預處理24小時，在低剪切應力下，小檗堿不能抑制p47phox磷酸化和Hyal2活化（圖3 E-G）。此外，實驗確定了p47phox和Hyal2的結合是否也受到小檗堿處理的影響。結果表明，小檗堿降低了低剪切應力誘導的p47phox/Hyal2 的解離（圖3 H）。所有數據都顯示，小檗堿通過 AMPK 激活抑制p47phox和 Hyal2的活化。

小檗堿逆轉HAS2的表達也依賴于AMPK活化

透明質酸合酶-2（HAS2）是合成透明質酸的關鍵酶。在這項研究中，蛋白質印跡顯示，低剪切應力以時間依賴性方式下調HAS2表達，30min時HAS2表達最小。然而，小檗堿可以改善低剪切應力降低的HAS2表達，且呈劑量依賴性。

為了研究低剪切應力降低HAS2表達的潛在機制至少部分是由于AMPK活性的變化，實驗用小檗堿和化合物C共同處理細胞，然后暴露于低剪切應力。蛋白質印跡顯示，小檗堿處理不能逆轉HAS2表達的降低，表明AMPK參與了HAS2表達的調節。此外，在敲低AMPKα1的同時，HAS2表達的變化也不受小檗堿處理的影響。相反，通過過表達AMPKα1然后暴露于低剪切應力，與對照組相比，HAS2表達顯著增加。這些結果表明，小檗堿通過AMPK通路調節HAS2活性。

然而沒有發現AMPK和HAS2之間的直接聯系。因此，測試了p47phox 是否參與HAS2的介導。用p47phox siRNA轉染時，低剪切應力不能顯著降低HAS2的表達。因此，低剪切應力通過AMPKα/p47phox 通路誘導HAS2表達的變化。

總之，小檗堿調節低剪切應力誘導的透明質酸降解不僅抑制了p47phox 和Hyal2活性，也增強了HAS2的表達。

圖4   BBR介導透明質酸代謝作用的示意圖

BBR可以逆轉LSS誘導的透明質酸損傷。該過程可能是通過調節AMPK活化，然后減少p47phox的磷酸化和 Hyal2 激活。此外，BBR還減弱了LSS誘導的HAS2失活。同樣，HAS2的表達也受到AMPK活性的調節。因此，合成和分解代謝均受BBR調節。

總之，該研究表明，小檗堿處理可以通過增加AMPKa的磷酸化來減弱低剪切應力誘導的透明質酸降解，進而下調 p47phox和Hyal2活性，并上調HAS2的表達。

參考文獻：Yang H, Zhu L, Gu Y, Kong X, Yan Liu, Chen M, Xie X, Luo J, Chen S. Berberine inhibits low shear stress-induced glycocalyx degradation via modulating AMPK and p47phox/Hyal2 signal pathway. Eur J Pharmacol. 2019 Aug 5;856:172413. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172413. Epub 2019 May 29. PMID: 31152700.

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