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在一項(xiàng)新的研究中，一個(gè)由17個(gè)實(shí)驗(yàn)室組成的聯(lián)盟提供的結(jié)果與一項(xiàng)高度引用的研究[1]---它描述了一種利用CRISPR構(gòu)建條件性基因敲除小鼠的技術(shù)---相矛盾。這項(xiàng)新的研究表明與那項(xiàng)原始的研究[1]相比，這種技術(shù)的效率要低得多。相關(guān)研究結(jié)果[2]于2018年9月1日發(fā)表在預(yù)印本服務(wù)器bioRxiv上，論文標(biāo)題為“Re-Evaluating One-step Generation of Mice Carrying Conditional Alleles by CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing Technology”。

這項(xiàng)新研究的結(jié)果指出了那項(xiàng)原始研究的局限性，后者取得的成功似乎被歸因?yàn)樘蕹s合小鼠品系中的特定基因。根據(jù)谷歌學(xué)者（Google Scholar）的統(tǒng)計(jì)，那項(xiàng)原始研究被引用了將近1000次。它的主要作者堅(jiān)持認(rèn)為他的方法是強(qiáng)有力的。
 

圖片來(lái)自bioRxiv, doi:10.1101/393231。

在美國(guó)懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所遺傳學(xué)家Rudolf Jaenisch及其同事們?cè)?013年發(fā)表那項(xiàng)原始研究[1]之前，胚胎干細(xì)胞被用來(lái)制備條件性基因敲除小鼠---在需要缺失一個(gè)基因的情形下，動(dòng)物的基因經(jīng)改造后被關(guān)閉---這個(gè)過(guò)程可能需要數(shù)年時(shí)間，成功率僅為1％。CRISPR技術(shù)提供一站式服務(wù)，它所構(gòu)建出的條件性基因敲除小鼠的成功率為16％。通過(guò)將CRISPR復(fù)合物注射到受精卵中，Jaenisch團(tuán)隊(duì)成功地將一個(gè)待剔除的基因放置在兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間，從而允許這個(gè)基因受到條件性調(diào)節(jié)。

美國(guó)康奈爾大學(xué)干細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因核心機(jī)構(gòu)主任John Schimenti說(shuō)（未參與這兩項(xiàng)研究），“Jaenisch發(fā)表的那項(xiàng)初研究是一個(gè)里程碑，它當(dāng)然證實(shí)了你能夠在特定的位點(diǎn)上獲得非常的突變。”

條件性基因敲除小鼠在生物醫(yī)學(xué)研究中是非常重要的，這是因?yàn)樗鼈冏尶茖W(xué)家們?cè)谟袡C(jī)體的特定組織中以及在發(fā)育期間的特定時(shí)間剔除必需基因。盡管Jaenisch開(kāi)發(fā)的這種方法很有前景，但是試圖利用該技術(shù)構(gòu)建出條件性基因敲除小鼠的研究團(tuán)隊(duì)并沒(méi)有那么成功。

Schimenti說(shuō)，“所有試圖利用他們初提出的這種方法制備出的floxed等位基因（譯者注：在遺傳學(xué)中，floxed是‘flanked by LoxP’的縮寫(xiě)，指的是將一個(gè)等位基因以三明治的形式放置在兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間。在Cre重組酶的催化下，兩個(gè)LoxP位點(diǎn)發(fā)生重組，從而剔除這兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的等位基因。）通常都會(huì)遭遇失敗。”Schiment已在康奈爾大學(xué)干細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因核心機(jī)構(gòu)觀察到與這項(xiàng)新的研究提及到的“相同的問(wèn)題”。

Schimenti指出，Jaenisch開(kāi)發(fā)的這種方法通常會(huì)導(dǎo)致脫靶突變，缺失或者無(wú)法以正確的方向插入兩個(gè)LoxP位點(diǎn)。他說(shuō)，“這一點(diǎn)在科學(xué)界中得到普遍認(rèn)可，簡(jiǎn)言之，取得與Jaenisch團(tuán)隊(duì)報(bào)道的成功率相相近的結(jié)果是非常困難的。” 

在學(xué)術(shù)會(huì)議和其他地方，一個(gè)緊密結(jié)合的研究團(tuán)體針對(duì)其他實(shí)驗(yàn)室利用這種技術(shù)所面臨的挑戰(zhàn)開(kāi)展的討論使得主管澳大利亞國(guó)立大學(xué)轉(zhuǎn)基因機(jī)構(gòu)的Gaetan Burgio和他的同事們?cè)噲D確定出了什么問(wèn)題。

首先，三個(gè)實(shí)驗(yàn)室在不同的小鼠品系中復(fù)制了這項(xiàng)靶向同一個(gè)基因的原始實(shí)驗(yàn)，但沒(méi)有取得成功。接下來(lái)，包括這三個(gè)實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的17個(gè)實(shí)驗(yàn)室在5種不同的小鼠品系中針對(duì)小鼠基因組中的總共56個(gè)基因和2個(gè)基因間區(qū)域獨(dú)立地重復(fù)這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。來(lái)自所有這些實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)集經(jīng)合并后包括17887個(gè)顯微注射或電穿孔的小鼠受精卵和產(chǎn)生的1718只活小鼠，其中僅15只小鼠具有條件性對(duì)照所需的兩個(gè)插入的LoxP位點(diǎn)。在所有接受測(cè)試的小鼠中，觀察到脫靶的缺失或突變代替LoxP位點(diǎn)的正確插入。

與那項(xiàng)原始研究在小鼠中獲得條件性敲除等位基因的效率為16％相比，Burgio和其他人的成功率僅為0.87％。Burgio說(shuō)，“這種方法的成功率. . .相當(dāng)于使用胚胎干細(xì)胞的經(jīng)典方法。”

這17個(gè)實(shí)驗(yàn)室旨在找出導(dǎo)致成功地構(gòu)建出條件性基因敲除小鼠的潛在因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)插入兩個(gè)LoxP位點(diǎn)對(duì)這種技術(shù)的成功是至關(guān)重要的。

Jaenisch認(rèn)為這兩項(xiàng)研究中使用的小鼠品系之間的差異是癥結(jié)之所在，也是這兩項(xiàng)研究之間存在的很大差異的根本原因。Jaenisch對(duì)這項(xiàng)新研究的質(zhì)量提出了質(zhì)疑，“我不得不認(rèn)為這些數(shù)據(jù)是不可靠的”。

Schimenti對(duì)此表示贊同，認(rèn)為在重復(fù)那項(xiàng)原始研究時(shí)應(yīng)考慮遺傳背景。“我認(rèn)為這是這項(xiàng)發(fā)表在bioRxiv上的研究存在的缺陷---如果他們測(cè)試Jaenisch的研究結(jié)果，他們應(yīng)該使用*相同類型的動(dòng)物。”不過(guò)，Burgio和Schimenti提出一點(diǎn)：相比于這項(xiàng)新的研究中使用的小鼠，Jaenisch使用的小鼠品系并不常見(jiàn)。

Schimenti還提出了Jaenisch取得的16％成功率可能代表著那項(xiàng)原始研究中使用的特定小鼠品系中的單個(gè)基因座。Schimenti說(shuō)，“我認(rèn)為很明顯這是一個(gè)非常有問(wèn)題的技術(shù)。還需要有一個(gè)解決方法。”（生物谷） 

原始出處：
Study Challenges CRISPR Method for Making Conditional Knockout Mice

參考資料：
1.Hui Yang，Haoyi Wang，Chikdu S. Shivalila et al. One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell, 12 September 2013, 154(6):1370-1379, doi:10.1016/j.cell.2013.08.022

2.Channabasavaiah Gurumurthy, Rolen Quadros, John Adams Jr. et al. Re-Evaluating One-step Generation of Mice Carrying Conditional Alleles by CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing Technology. bioRxiv, Published Online: 1 September 2018, doi:10.1101/393231