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蛋白質(zhì)純化試劑 鎳-瓊脂糖凝膠 6FF（HIS 標簽純化樹脂）
貨號：P2010
規(guī)格：5ml/ 10ml（凝膠體積）
保存 ：4°C 保存，有效期少一年

產(chǎn)品說明：
    Ni-NTA瓊脂糖凝膠 6FF是用于純化 6×His標簽重組蛋白的一種純化介質(zhì)，它是由 6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達系統(tǒng)表達的 6×His標簽重組蛋白。
    NTA，含有四個螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni 2+ 。6×His可與Ni 2+ 螯合，從而使His標簽蛋白結(jié)合在Ni-NTA純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來，從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質(zhì)與His標簽蛋白具有的親和力，可達 5-20 mg/ml。
    可在非變性和變性條件下純化任何表達系統(tǒng)所得的His標簽蛋白。純化程序簡單，所得的蛋白純度可高達 95％。
    Ni-NTA可再生 4-6 次，重復使用。本產(chǎn)品懸浮液為 20％乙醇，已螯合Ni 2+ 。

操作方法：
A.  非變性條件下抽提 His  標簽蛋白
     1) 準備細胞，接種，誘導表達。收集細胞，置于-70°C 或立即進行步驟 2 操作。
     2) 加入 1/20 細胞生長體積的 NTA-0 Buffer 和 PMSF。PMSF 使用的工作濃度為 1 mM 現(xiàn)用現(xiàn)加。
     3) 將細胞懸浮起來，加入溶菌酶，混勻，冰上放置 30 分鐘，超聲或勻漿破碎細胞。該步驟冰上操作。
     4) 加入 10% Triton X-100, 使終濃度為 0.05%，充分混勻，冰上放置 15 分鐘。
     5) 12000 rpm/min(20,000×g 以上)，4°C 離心 15 分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20°C 保存。
     6) 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗。
     7) 將樣品加 NTA 層析柱中，流速在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用 SDS/PAGE 分析蛋白的結(jié)合情況。
     8) 層析用 5 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗，流速控制在 30 ml/h 左右。
     9) 分別用 5 倍 NTA 體積的 NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脫，流速控制在 15 ml/h 左右，收集洗脫液，每管收集一個 NTA 體積。
    10) 確定目標蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。 為有效的方式是 SDS-PAGE 分析。 也可以用 Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布。
    11)純化的目標蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。
NTA-0 、 20、 40、 60、 80、 100、 200、 1000Buffer 分別為濃度 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol，添加 0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。
B. 變性條件下從包涵體中純化 His  標簽蛋白
    1) 準備細胞，接種，誘導表達。收集細胞，置于-70°C 或立即進行步驟 2 操作。
    2) 加入 1/20 細胞生長體積的 GuNTA-0 Buffer 和 PMSF。PMSF 使用的工作濃度為 1 mM 現(xiàn)用現(xiàn)加。
    3) 將細胞懸浮起來，冰上超聲破碎細胞，降低粘稠度。
    4) 室溫放置 30 分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。
    5) 12000 轉(zhuǎn)/分（20,000×g 以上），4°C 離心 15 分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20°C 保存。

    6) 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 GuNTA-0 Buffer 洗。
    7) 將樣品加到 NTA 層析柱中，流速控制在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。
    8) 層析用 5 倍 NTA 體積的 GuNTA-0 Buffer 洗，流速控制在 30 ml/h 左右。
    9) 分別用 5 倍 NTA 體積 GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500 洗脫，流速在15 ml/ h 左右，收集洗脫液，每管收集一個 NTA 體積。
    10) 確定目標蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。 為有效的方式是 SDS/PAGE 分析。 也可以用 Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布。
   11) 目標蛋白質(zhì)需要進一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。
   12) 純化的目標蛋白質(zhì)需要復性，復性常用的手段可以參考有關手冊確定的原則。
GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer 分別為濃度 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M
Guanidium HCl 添加 0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。
C. NTA  樹脂的再生
    NTA 樹脂在使用若干次數(shù)（3-5 次）后，結(jié)合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。NTA 樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計出 NTA 的樹脂體積，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋铮?在等上一步再生溶液流干后， 再加下一步再生溶解。 用戶需要自行準備 25%、 50%、75%、100%（v/v）乙醇和去離子水。
從層析柱下端流干所有溶液，用 2 倍 NTA 樹脂體積的 Stripping Solution I、2 倍體積的去離子水、3 倍體積的 Stripping Solution II、1 倍體積的 25%乙醇、1 倍體積的 50%乙醇、1 倍體積的 75%乙醇、5 倍體積的 100%乙醇、 1 倍體積的 75%乙醇、 1 倍體積的 50%乙醇、 1 倍體積的 25%乙醇、 1 倍體積的去離子水、 5 倍體積的 StrippingSolution III、3 倍體積的去離子水分別洗一遍。
如果立即使用， 用 5 倍體積的 Ni Charging Solution 洗， 再用 10 倍體積的平衡溶液 （NTA-0Buffer 或 GuNTA-0Buffer）洗；如果想長期儲存，加入 1 倍體積的 20%乙醇，4°C 保存，使用前用 5 倍體積的 Ni Charging Solution洗，再用 10 倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer 或 GuNTA-0 Buffer）洗再生溶液配方：Stripping Solution I: 6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。
Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

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T1150  1M Tris-HCl(PH=8.0)
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PC0020 BCA 蛋白濃度測定試劑盒
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I1020  IPTG  溶液 (50mg/ml)

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